昆蟲E93轉錄因子是蛻皮激素下游的初級應答因子之一,在昆蟲由蛹向成蟲變態(tài)發(fā)育期間發(fā)揮著重要作用。E93既參與調控昆蟲變態(tài)期間幼蟲組織的細胞程序性死亡,同時也調控成蟲組織器官的形成。但目前有關E93調控成蟲組織器官形成的分子機制的研究還很少。E93最早在果蠅中被鑒定到,其在預蛹期和蛹期特異性表達;在蛹變態(tài)期,果蠅幼蟲器官如唾液腺和中腸等發(fā)生凋亡,而翅原基卻經(jīng)歷劇烈的形態(tài)變化過程最終發(fā)育為成蟲的翅�；谟计诔岬膭×易儜B(tài)發(fā)育及成蟲翅表型易于觀察等優(yōu)點,翅常作為研究器官發(fā)育的理想模型。在本研究中,我們以果蠅為模式生物探究了E93轉錄因子調控翅發(fā)育的分子機制。采用Gal4/UAS系統(tǒng)對果蠅E93基因進行翅特異性RNAi后觀察表型,利用ChIP-seq數(shù)據(jù)分析篩選E93下游的潛在作用靶標,并通過在細胞及組織水平的分子生物學檢測和個體水平的表型觀察,最終解析了E93轉錄因子調控果蠅翅發(fā)育的分子機制。取得的主要研究結果如下:1.果蠅E93基因的翅特異RNAi對翅發(fā)育的影響為了探究果蠅翅中E93的表達對翅發(fā)育的影響,我們采用Gal4/UAS系統(tǒng)對果蠅E93基因進行翅特異性RNAi。本實驗中共選用了4種果蠅翅特異性Gal4品系(nubbin-Gal4、MS1096-Gal4、ptc-Gal4和en-Gal4)和2種E93基因RNAi品系(V104390和#57868)。首先,利用Gal4/UAS系統(tǒng)檢測了4種翅特異性Gal4在翅中的表達模式。通過將翅特異性Gal4品系的處女蠅分別與表達紅色熒光蛋白的UAS-Cherry品系的雄蠅雜交,取其子代翅原基檢測紅色熒光蛋白的表達部位。結果顯示,nubbin-Gal4驅動紅色熒光蛋白在整個翅囊區(qū)表達;MS1096-Gal4驅動紅色熒光蛋白在背區(qū)(D區(qū))的翅囊區(qū)表達;en-Gal4和ptc-Gal4分別驅動紅色熒光蛋白在翅原基后區(qū)(P區(qū))和前區(qū)/后區(qū)(A/P)分界處表達。我們選取表達范圍最廣的nubbin-Gal4分別與果蠅E93基因的兩種RNAi品系(V104390和#57868)及相應的對照品系進行雜交,并取其子代翅原基通過RT-PCR和qRT-PCR檢測E93基因的表達。結果顯示,與對照組相比,E93基因的翅特異性RNAi導致翅中E93的表達水平顯著降低。表型觀察和統(tǒng)計結果顯示,果蠅E93基因的翅特異性RNAi引起成蟲翅變小和翅脈發(fā)育異常,兩組中E93基因RNAi后的翅面積分別減少了76.2%和82%。另外,我們利用MS1096-Gal4、ptc-Gal4和en-Gal4這三種翅特異性Gal4分別與E93基因RNAi品系V104390進行雜交,其子代同樣表現(xiàn)出了翅變小和翅脈缺陷的表型。以上結果表明,E93在果蠅翅發(fā)育過程中發(fā)揮著極為重要的調控作用。2.基于ChIP-Seq數(shù)據(jù)篩選果蠅E93的潛在靶基因為了解析E93調控果蠅翅發(fā)育的分子機制,我們對果蠅E93在翅中的ChIP-seq數(shù)據(jù)進行了分析,以篩選E93的潛在靶基因。全基因組定位分析顯示,28.51%的E93 ChIP峰位于基因啟動子區(qū)(定義為轉錄起始位點上游2000bp的區(qū)域),共對應1868個基因;43.96%的E93 ChIP峰位于內含子區(qū);13.65%的E93 ChIP峰位于基因間區(qū)。鑒于轉錄因子常通過與靶基因啟動子區(qū)的關鍵DNA基序結合發(fā)揮其轉錄調控作用,我們重點關注了啟動子區(qū)分布有E93 ChIP峰的1868個基因。GO功能注釋顯示,1868個基因中的513個基因富集于翅原基-翅變態(tài)這一生物學進程。進一步基于果蠅翅在蛹變態(tài)發(fā)育期的轉錄組數(shù)據(jù),分析了這513個基因在化蛹后6 h、18h、24 h、36 h和44 h共五個時間點的翅中的協(xié)同表達變化。根據(jù)其不同的表達模式,共聚類為8個簇,其中E93基因位于簇2中,其表達變化趨勢為在預蛹期開始逐漸上調表達,直至化蛹后24 h表達水平達到最高,而后表達又逐漸降低;513個基因中共有60個基因在蛹期具有和E93類似的表達模式。進一步對這60個基因進行KEGG通路富集分析,4條與翅發(fā)育相關的信號通路被富集,分別為:Dpp、MAPK、Notch和Hippo信號通路;4條信號通路中共富集到Dpp、Tkv、Sog、Nej、Numb、Ser、Wts、Baz、Kibra、Cka、Cic、Ttk共12個基因。3.果蠅E93調控翅發(fā)育的分子機制在基于ChIP-Seq數(shù)據(jù)篩選得到的果蠅E93的潛在靶基因中,我們注意到編碼Dpp信號通路配體的Dpp基因被富集且在蛹期的表達變化與E93類似,鑒于Dpp信號通路在果蠅翅發(fā)育過程中的重要作用已有廣泛報道,我們選擇了Dpp基因作為E93的潛在靶基因進行了深入探究。通過果蠅基因組數(shù)據(jù)庫FlyBase檢索發(fā)現(xiàn),果蠅Dpp基因共有4種亞型,分別為Dpp-RA、Dpp-RB、Dpp-RC和Dpp-RE。這4種亞型具有不同的啟動子區(qū),但經(jīng)剪切加工后編碼相同的蛋白產物。ChIP-Seq數(shù)據(jù)顯示,在Dpp基因啟動子區(qū)共存在6個E93 ChIP峰。Dpp-RA和Dpp-RB的啟動子區(qū)各有兩個峰,根據(jù)其距離轉錄起始位點的遠近分別命名為Dpp-RA-D(D,遠端)和Dpp-RA-P(P,近端)、Dpp-RB-D和Dpp-RB-P;在Dpp-RC和Dpp-RE的啟動子區(qū)各有一個E93 ChIP峰。果蠅S2細胞中的ChIP-PCR實驗結果表明,E93與Dpp啟動子區(qū)的6個ChIP峰均能直接結合。我們利用熒光素酶報告基因實驗分析了果蠅E93對Dpp啟動子活性的調控作用。結果顯示,E93過表達顯著上調了Dpp-RA和Dpp-RC亞型啟動子的活性,但對Dpp-RB和Dpp-RE亞型的啟動子活性無顯著影響。我們隨后檢測了E93對Dpp-RA和Dpp-RC亞型不同截短形式的啟動子活性的影響,結果顯示,E93過表達同樣可誘導只含有近端ChIP峰的Dpp-RA啟動子(Dpp-RA-P)的活性;但將Dpp-RA和Dpp-RC亞型啟動子上的ChIP峰區(qū)域全部截除后,E93過表達對其啟動子活性不再有顯著影響。以上結果表明,E93可以與Dpp啟動子直接結合并激活其啟動子活性。我們進一步分析了果蠅E93基因的表達改變對Dpp信號通路基因轉錄的影響。qRT-PCR結果顯示,nubbin-Gal4驅動的E93基因翅特異性RNAi導致翅中Dpp信號通路關鍵基因Dpp、Tkv和Mad的表達下調;在果蠅S2細胞中過表達E93則顯著上調了Dpp、Tkv和Mad的表達。另外,免疫熒光結果顯示,果蠅E93基因的翅特異性RNAi抑制了蛹期翅中Dpp的表達,并抑制了其對下游Mad的磷酸化和激活作用。我們還探究了Dpp信號通路基因表達改變對果蠅翅發(fā)育的影響。用果蠅翅特異的UAS-dicr2;nubbin-Gal4品系分別與Dpp、Tkv、Mad這三個Dpp信號通路關鍵基因的RNAi品系雜交,觀察子代表型。與野生型果蠅的翅相比,對Dpp、Tkv、Mad基因的翅特異性RNAi均導致成蟲翅顯著減小和翅脈的缺失,這與E93基因翅特異性RNAi所導致的表型類似。綜合分析表明,果蠅E93通過直接正調控Dpp信號通路關鍵基因影響了翅的發(fā)育。
【學位單位】：西南大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：Q963
【部分圖文】：

西南大學碩士學位論文空表達特征E93 基因存在 E93A 和 E93B 兩種亞型，二者具期的 20E 滴度高峰誘導，E93A 和 E93B 在預，直至化蛹后 24 小時（h）其表達量達到最；在化蛹后 60h 時 E93 表達再次升高，直至而后又呈現(xiàn)降低趨勢（圖 1.2）。另外，在家究也表明，E93 具有在蛹期特異性高量表達的

圖 1.3 E93 在果蠅不同組織中的表達[14]（30h APF） B.唾液腺（12h APF） C.胃盲腸（3h APF） D.馬氏管（15h A.成蟲中腸（21h APF） F-G.翅（36h APF） H-I.眼（39h APF） APF：化蛹Figure 1.3 Expression of E93 in different tissues of Drosophila[14] APF) B. salivary gland (12h APF) C. gastric caeca (3h APF) D. malpighian tubu midgut (21h APF) F-G.wing (36h APF) H-I.eye (39h APF) APF: after pupari轉錄因子的功能研究種轉錄因子，在昆蟲中 E93 通過響應蛻皮激素信號繼而調控時期特異性轉錄，在昆蟲由蛹向成蟲的變態(tài)發(fā)育過程中發(fā)揮道，在完全變態(tài)昆蟲如果蠅和赤擬谷盜中，全身性干涉 E9期不能正常發(fā)育和分化形成成蟲組織和器官，最終導致個另外，E93 在蛹期的多個組織中均有表達并發(fā)揮不同的調控功能的研究揭示了其在變態(tài)期間幼蟲唾液腺和中腸等組織的重要的調控功能[10, 17]，并且參與調控昆蟲變態(tài)發(fā)育期間脂

圖 1.4 E93 在幼蟲中腸細胞程序性死亡前表達[17]胃盲腸（三角箭頭）；成蟲中腸上皮細胞（箭頭）A-D. 果蠅蛹殼形成后的 2h（A）、4h（B）、6h（C）、13h（D）的中腸。Figure 1.4 E93 protein is expressed in larval midguts prior to programmed cell death[1gastric caeca (arrowheads), adult midgut epithelia (arrows)A-D. Midgut at 2h (A), 4h (B), 6h (C), 13h (D) after puparium formation in Drosophila..2 E93 轉錄因子在果蠅唾液腺中的功能果蠅蛹殼形成約 10h 后再次出現(xiàn) 20E 滴度高峰，促進其由預蛹向蛹的3]。與中腸開始凋亡的時期不同，E93 響應蛹期出現(xiàn)的 20E 滴度高峰中開始表達并促進其凋亡[24]。研究表明，E93 可特異性結合在唾液腺的多個位點上，這些位點包括蛻皮激素誘導的基因如 E74 和 E75 等，序性細胞死亡相關的基因如 dredd、crq 等[17]。另外，在 E93 突變個體亡相關的基因如 rpr、hid 和 dronc 等的表達均出現(xiàn)了下調。因此，E93 應蛻皮激素信號并調控下游細胞凋亡基因的表達，進而調控變態(tài)期間
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1 潘良文,胡永強,張舒亞;轉基因抗草甘膦油菜內源特異參照基因BnACCg8和外源E93'終止子的檢測研究[J];中國油料作物學報;2003年02期

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1 王偉娜;果蠅E93轉錄因子對翅發(fā)育的調控研究[D];西南大學;2019年

本文編號：2886351