過氧化氫酶能夠處理工業(yè)廢水中殘余的過氧化氫,所以它是在工業(yè)生產(chǎn)中一種重要的酶,但傳統(tǒng)過氧化氫酶耐熱性和耐酸堿性較差,這極大地限制了其在工業(yè)生產(chǎn)中的應用潛力。在之前的研究中,我們篩選并表達出一種新型的錳過氧化氫酶GeoMnCAT(GMC),具有較好的耐熱性和耐酸堿性,能在75℃和pH 9.0的反應條件下達到最大酶活力,但其表達量較低且需要IPTG進行誘導表達。因此尋求更適合GMC表達的宿主菌株和基因表達組件以提高酶的表達是急需解決的問題。在本項研究中,錳過氧化氫酶GMC基因被構(gòu)建于穿梭質(zhì)粒pBS-S內(nèi),并以枯草芽孢桿菌RIK1285作為宿主菌株對錳過氧化氫酶GMC進行表達。同時,從信號肽文庫中篩選出48種適于錳過氧化氫酶GMC表達的枯草芽孢桿菌同源信號肽(45種Sec信號肽,3種Tat信號肽)。隨后選擇3種不同類型的啟動子(組成型啟動子P_(43)、誘導型啟動子P_(glv)、時期特異型啟動子P_(aprE))插入到重組穿梭質(zhì)粒中并從中篩選出最適于錳過氧化氫酶GMC表達的啟動子。結(jié)果顯示,Sec分泌途徑的信號肽能更高效地促進外源蛋白的表達,其中信號肽yoqH能最大程度提高GMC表達量至46.08 U/mL。同時,我們通過SingalP軟件計算得到不同信號肽的物理化學性質(zhì)的參數(shù),并將其與相應蛋白分泌水平的進行了相關(guān)性分析,發(fā)現(xiàn)代表分泌蛋白的N-末端氨基酸序列與信號肽之間的組合效率的D-score值與表達量呈負相關(guān)。在優(yōu)化啟動子后,組成型啟動子P_(43)能夠最大程度上提高錳過氧化氫酶GMC的表達量至143.77 U/ml。同時,誘導型啟動子P_(glv)和時期特異型啟動子P_(aprE)也能夠較大程度上提高錳過氧化氫酶GMC的表達分別至115.33 U/mL和107.6 U/mL。相較于在大腸桿菌表達系統(tǒng)中產(chǎn)出的錳過氧化氫酶,經(jīng)信號肽和啟動子優(yōu)化的在枯草芽孢桿菌中表達的錳過氧化氫酶最高被提升至其4.74倍。這項研究將錳過氧化氫酶GMC在枯草芽孢桿菌進行表達并通過分子水平優(yōu)化,將錳過氧化氫酶的酶活提高至之前由大腸桿菌表達系統(tǒng)的4.74倍。這項工作為錳過氧化氫酶在工業(yè)的應用提供了可能性。
【學位單位】：吉林大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：Q78;Q936
【部分圖文】：

也被稱為觸酶（Catalase，簡稱 CAT）。過氧化氫酶以 H2O2作為底物，通過酶活催化一對電子的轉(zhuǎn)移進而將 H2O2分解成水和氧[2]。Sumner 于 1937 年得到牛肝過氧化氫酶結(jié)晶之后，生物學家開始嘗試利用多樣的方式從不同微生物以及動物組織中獲取過氧化氫酶[3,4,5]，如在 1948 年 Pinsent 等首次從藤黃微球菌中提取到了錳過氧化氫酶。近年來研究發(fā)現(xiàn)，過氧化氫酶能夠有效除去造紙、醫(yī)藥和紡織工業(yè)中的氧化劑-H2O2[6]可以作為一種替代化學處理、低成本且無污染的除 H2O2的方法[6,7]廣泛應用于紡織業(yè)、食品工業(yè)、工業(yè)酶催化等。過氧化氫酶可依據(jù)獲得途徑的不同分為真核過氧化氫酶和原核過氧化氫酶，前者大部分來自于動植物組織，后者主要來源于微生物[7,8]。Goldberg 于 1989 年將過氧化氫酶按照結(jié)構(gòu)和序列差異劃分為三個亞群[9,10]，分別為單功能過氧化氫酶（Typical catalase）、雙功能過氧化氫酶(Catalase-peroxidase, CAT-POD)和錳氧化氫酶(Mn-catalasee)。同時，以催化中心結(jié)構(gòu)特點可分為(1)含鐵卟啉結(jié)構(gòu)的 CAT，又稱鐵卟啉酶；(2)含錳離子替代鐵的卟啉結(jié)構(gòu)的 CAT，又稱錳過氧化氫酶(MnCAT)。

圖 3.1 不同分泌途徑的信號肽注：A, B, C 和 D 分別代表 Sec 依賴性信號肽，Tat 依賴性信號肽，ABC 依賴性信號肽和 P依賴性信號肽。箭頭指向切割位點。1.5.2 Sec-SRP 分泌途徑識別和定位作用。在合成前體蛋白后，細胞質(zhì)伴侶保證了前蛋白在信號肽信號識別粒子（SRP）識別之前聚集了易位能力狀態(tài)，并與 SRP 受體 FtsY 結(jié)36]。高度保守的核糖核蛋白復合物 SRP 由 scRNA 和兩種類組蛋白蛋白（HBsu和 Ffh 組成，F(xiàn)fh 是一種與 scRNA 相互作用并形成穩(wěn)定復合物的含 446 個氨基的蛋白質(zhì)�？莶菅挎邨U菌的 SRP RNA 含有 Alu 結(jié)構(gòu)域，其通過與結(jié)合核糖體延伸因子競爭來阻止蛋白質(zhì)生物合成。延遲翻譯使 SRP 有時間與其膜受體 Fts相互作用。DNA 結(jié)合蛋白 HU1（HBsu 的一部分）被認為是細菌 Alu 結(jié)構(gòu)域一部分[39]。

圖 2.1 穿梭質(zhì)粒 pBE-S 質(zhì)粒圖譜穿梭質(zhì)粒 pBE-S 包含: 2 個復制起始點（ColE ori 和 pUBori）、2 個抗性基Ampr和 Kanr）、1 個啟動子 PaprE、1 個信號肽 aprE、1 段多克隆位點（MSC）.3 枯草芽孢桿菌感受態(tài)制備（1）將宿主菌株枯草芽孢桿菌 RIK1285 的甘油管菌液通過平板劃線法接種 LB 培養(yǎng)基平板，37℃孵育過夜，約 16 小時。（2）用接菌環(huán)挑取生長狀態(tài)良好的單菌落接種至 2 mL LB 培養(yǎng)基，28℃，0-180rpm 過夜培養(yǎng)。（3）將步驟（2）中培養(yǎng)液取 50μL 加入 5mL SP I 緩沖液中，37℃，180 rpm。加入 1 小時后開始，每 30 分鐘測量 OD660 值以確定菌株生長情況，一旦培養(yǎng)入平臺期便終止培養(yǎng)。（4）將步驟（3）中培養(yǎng)液取 0.5 ml 加入 4.5 mL SP II 緩沖液中，37℃，9000 rpm 下孵育 90 分鐘。
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本文編號：2881537