發(fā)布時間：2020-11-10 19:02

　　 枯草芽孢桿菌高溫發(fā)酵的醬香型食品(如白酒)、中低溫發(fā)酵的豉香型食品(如豆豉)都受到人們的青睞,但醬香和豉香的產(chǎn)生機(jī)制至今還不清楚。研究通過對豆豉工業(yè)生產(chǎn)菌株Bacilus subtilis BJ3-2進(jìn)行中溫(45℃)和中低溫(37℃)的轉(zhuǎn)錄組測序差異性和富集分析,篩選得到19個差異顯著基因,分析選取5個顯著差異基因作為風(fēng)味候選基因并進(jìn)行熒光驗證,最終選取rocF(精氨酸酶)進(jìn)行同源重組,雙交換敲除以驗證其在醬(豉)香上的生理功能,主要研究內(nèi)容及結(jié)果如下:1.對Bacilus subtilis BJ3-2中溫(45℃)、中低溫(37℃)進(jìn)行第二代轉(zhuǎn)錄組測序。通過表達(dá)量分析、差異基因的GO、KEGG注釋和富集分析,將差異顯著的58個基因富集在27個代謝通路,其中嘧啶代謝、精氨酸和脯氨酸代謝、丙氨酸,天冬氨酸和谷氨酸代謝最為顯著�？刂坪Y選條件Fold-change≧2與FDR≦0.05,最終篩選出19個顯著差異基因,結(jié)合文獻(xiàn)報道和綜合分析,選擇rocF(精氨酸酶)、rocG(谷氨酸脫氫酶)、uxaC(葡萄糖醛酸異構(gòu)酶)、uxuA(甘露酸脫氫酶)、pckA(磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶)為醬(豉)香候選基因。2.對轉(zhuǎn)錄組篩選出來的5個醬(豉)香候選基因進(jìn)行熒光定量PCR驗證。選用16S rRNA為內(nèi)參基因,分別確定了5個醬(豉)香候選的基因的溶解曲線和擴(kuò)增曲線,并計算出各自的基因表達(dá)差異,結(jié)合轉(zhuǎn)錄組差異發(fā)現(xiàn),除uxaC外,rocF、rocG、uxuA、pckA的表達(dá)趨勢和轉(zhuǎn)錄組測序的結(jié)果一致。3.構(gòu)建rocF的同源重組雙交換敲除載體:pUC18+HLarm+CmR+HRarm。以pUC18為初始載體,依次通過Sac I、BamH I、Pst I、Hind III限制性酶切位點將從BJ3-2基因組擴(kuò)增的左臂(HLarm)、右臂(HRarm)以及pHT01cas9-p43載體上的氯霉素基因(CmR)連接,并通過菌落PCR、質(zhì)粒PCR、雙酶切、測序驗證,最終獲得pUC18+HLarm+CmR+HRarm重組交換載體。4.將雙交換質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化BJ3-2中,轉(zhuǎn)化效率達(dá)5×10~2cfu/μg,并通過革蘭氏染色、RCR驗證、測序驗證,最終成功篩選出BJ3-2△rocF基因敲除菌株。5.利用BJ3-2△rocF和BJ3-2發(fā)酵豆豉,感官評定和氨氣檢測顯示:BJ3-2△rocF發(fā)酵的豆豉較BJ3-2發(fā)酵的豆豉,37℃時,顏色、豉香、醬香、質(zhì)地、氨味均無明顯變化,僅黏絲略有降低;45℃時,顏色褐化程度降低,黏性增強(qiáng),醬香味更加突出,氨味降低112.9 ppm。由實驗結(jié)果得出:BJ3-2△rocF和BJ3-2 37℃發(fā)酵的豆豉感官變化不大,說明37℃時rocF與醬豉香風(fēng)味無顯著關(guān)系;傳統(tǒng)認(rèn)為褐化與醬香呈正相關(guān),但45℃時,BJ3-2△rocF發(fā)酵的豆豉褐化程度減弱,說明褐化與醬香風(fēng)味沒有相關(guān)性,醬香味增強(qiáng)說明rocF是醬香風(fēng)味重要的負(fù)調(diào)控基因,氨味降低,說明rocF通過精氨酸代謝影響氨氣含量。研究通過成功敲除rocF,為研究醬(豉)香風(fēng)味基因的功能提供了方法借鑒;通過轉(zhuǎn)錄組測序、熒光定量PCR驗證、基因敲除等手段為探索醬香和豉香型產(chǎn)品中風(fēng)味的形成機(jī)制提供了一定的理論基礎(chǔ)。
【學(xué)位單位】：貴州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：TS201.3
【部分圖文】：

圖 1.1 Bacilus subtilis 中 TTMP 的產(chǎn)生途徑Figure 1.1 Pathway of TTMP production in bacillus subtilis香風(fēng)味基因的篩選方法方法有很多，主要有 mRNA 差異顯示技術(shù)（楊曉霞 等，宏 等，2017）、轉(zhuǎn)錄組測序（汪最 等，2018）、抑制消減、基因敲除（張慧 等，2014）、基因突變（趙銀娟 等，2 等，2016）、生物信息學(xué)、實時熒光定量 PCR 等，一般，但為保證篩選可信度，要根據(jù)研究對象、研究目的以及實研究。技術(shù)酸行使功能的主要承擔(dān)者，是細(xì)胞功能和狀態(tài)最直接的描述生物功能的必然紐帶，轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控是目前研究最多，也是

圖 1.2 同源重組交換示意圖Figure 1.2 Schematic diagram of homologous recombination exchange基因敲除或整合的主要步驟包括:(1)構(gòu)建重組載體。(2)電擊、化學(xué)誘導(dǎo)等方法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞。(3)篩選目的細(xì)胞或菌落。(4)傳代培養(yǎng)并篩選已敲除或已整合的宿主。(5)進(jìn)行形態(tài)觀察及分子生物學(xué)檢測。1.3.2 同源重組在枯草芽孢桿菌中的運用同源重組被發(fā)現(xiàn)后，科學(xué)家們很快就將該技術(shù)運用到生物學(xué)的各個領(lǐng)域。同源重組技術(shù)也被運用到了 Bacilus subtilis 上，Bacilus subtilis 由于高蛋白分泌能力和良好發(fā)酵基礎(chǔ)被廣泛地運用在工業(yè)生產(chǎn)中，為了提高菌株的優(yōu)良特性，就需要對菌株進(jìn)行分子改造張明俐（張明俐 等，2016）等利用同源重組技術(shù)，快速構(gòu)建枯草芽孢桿菌 168（Bacilusubtilis168）spo0A 敲除載體 pMAD-Δspo0A，無痕敲除后得到了不長芽孢的枯草芽孢桿菌，對提高枯草芽孢桿菌工業(yè)生產(chǎn)效率有重要意義；張懿翔（張懿翔 等，2015）等通過同源重組將透明顫菌血紅蛋白(VHb)基因(vgb)整合到枯草芽孢中，改善枯草芽孢桿菌

貴州大學(xué)碩士畢業(yè)論文4. 通過限制性內(nèi)切酶（Sac I 和 BamH I）將 Bacilus subtilis BJ3-2 基因組中擴(kuò)增的上游同源臂（HLarm ）通過連接 轉(zhuǎn)化到大腸桿菌 DH5α 中， 提取得到質(zhì)粒pUC18+HLarm+p43+cat+HRarm。5. pUC18 為克隆載體，只添加 p43 啟動子和氯霉素的編碼區(qū)，沒有終止子并不能使菌株帶有氯霉素抗性，因此對先前構(gòu)建的 pUC18+HLarm+p43+cat+HRarm 載體進(jìn)行完善，利用 Pst I、BamH I 酶切位點將質(zhì)粒上的 p43+cat 替換成從 pHT01cas9-p43 質(zhì)粒 上 帶 有 啟 動 子 、 編 碼 區(qū) 、 終 止 子 的 CmR 基 因 。 利 用 在 線 網(wǎng) 址（http://molbiol-tools.ca/Promoters.htm）中的 BPROM 和 FindTerm 對 pHT01cas9-p43質(zhì)粒上的 CmR 基因進(jìn)行原核啟動子和終止子分析預(yù)測，確定無誤后進(jìn)行后續(xù)實驗。構(gòu)建示意圖，如圖 2.1 所示（利用軟件 SnapGene 制作）。
【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 尚柯;韓興林;王德良;舒冬梅;陳耀;;醬香白酒高溫堆積酒醅揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的檢測分析[J];中國釀造;2016年02期

2 趙銀娟;嚴(yán)芳;吳小芹;;枯草芽孢桿菌3610 ClpQY基因缺失突變株的構(gòu)建及其功能[J];東北林業(yè)大學(xué)學(xué)報;2015年11期

3 溫賽;楊建國;王鳳寰;汪兵;;中溫α-淀粉酶基因在枯草芽孢桿菌中的整合及高效表達(dá)[J];北京化工大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版);2015年04期

4 劉佳慧;王修俊;艾靜汶;尹爽;田多;王紀(jì)輝;楊志波;;貴州特色水豆豉制曲工藝及生長因子優(yōu)化的研究[J];食品科技;2015年07期

5 朱德麗;謝和;李茂琴;;利用抑制消減雜交技術(shù)分離醬香風(fēng)味的相關(guān)基因[J];貴州農(nóng)業(yè)科學(xué);2015年06期

6 索化夷;趙欣;騫宇;陳娟;李鍵;張玉;闞建全;;永川豆豉發(fā)酵過程中香氣的變化[J];食品科學(xué);2015年20期

7 楊曉霞;何仕武;趙汝麗;魏云林;林連兵;季秀玲;張琦;;mRNA差異顯示技術(shù)研究低溫條件下深黃被孢霉基因的表達(dá)差異[J];云南大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版);2015年02期

8 楊勝遠(yuǎn);韋錦;楊兵;連俊華;林錚;張少映;;細(xì)菌型黑豆豆豉發(fā)酵工藝及其功能性成分研究[J];核農(nóng)學(xué)報;2014年04期

9 張慧;陳莉;趙思峰;;枯草芽孢桿菌S44菌株ituD基因敲除突變株的構(gòu)建[J];湖北農(nóng)業(yè)科學(xué);2014年06期

10 蔣婭婷;曹錦軒;張玉林;廖國周;潘道東;沈建良;陳興邦;;蛋白質(zhì)與揮發(fā)性風(fēng)味成分相互作用研究進(jìn)展[J];核農(nóng)學(xué)報;2014年02期

本文編號：2878241