火龍果作為一種典型的熱帶水果,近年來在種植上已成為農(nóng)業(yè)新、特、優(yōu)、高開發(fā)項目。尤其是紅肉和紫紅肉火龍果,它們色澤艷麗、營養(yǎng)豐富。這主要是由于其含有特殊的甜菜紅素,甜菜紅素價值很高,不僅可作為著色劑應用于工業(yè)生產(chǎn)中,還可開發(fā)成藥品用于臨床治療。目前火龍果色素的生物合成代謝途徑己基本清晰,代謝途徑中的一些關鍵酶也得以分離和克隆,但色素的調(diào)控機制還不是很清楚。實驗室前期成功構建了不同發(fā)育時期貴州培育的紫紅肉品種(紫紅龍)和白肉品種(晶紅龍)果實全長轉錄本,并從中篩選出與色素相關差異表達的bHLH轉錄因子EST片段,進而豐富火龍果色素合成的分子調(diào)控機理,為培育出火龍果優(yōu)質(zhì)品種提供理論依據(jù)。基于轉錄組數(shù)據(jù),從中篩選到了6個差異表達bHLH轉錄本序列。本文以不同發(fā)育時期火龍果為材料,利用qRT-PCR對可能與色素相關的bHLH轉錄因子進行了篩選,采用RT-PCR方法克隆了一個與色素可能相關的bHLH轉錄因子(HubHLH2)全長序列,成功構建其誘餌載體,建立了酵母雙雜交文庫并進行了酵母文庫篩選。主要研究結果如下:1.利用qRT-PCR技術分析6個bHLH候選基因在火龍果不同發(fā)育時期的表達情況,結果顯示:在不同的發(fā)育時期HubHLH11270、HubHLH3826、HubHLH49630、HubHLH54630這些轉錄因子并沒有呈現(xiàn)出很明顯變化趨勢。HubHLH1637在紅肉中表達量呈明顯上升趨勢,但在白肉中呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢。而HubHLH2在紅肉中表達量恰恰相反它呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢,在白肉中的表達量從整體上看要比在紅肉中高,且紅白肉間存在差異。2.根據(jù)三代轉錄組數(shù)據(jù),運用RT-PCR技術,從火龍果中克隆出了一個bHLH轉錄因子,命名為HubHLH2。該基因的ORF為1524 bp,編碼508個氨基酸,其含有bHLH-MYC_N結構域以及典型的HLH保守結構域。其分子量為124.55KD,pI為5.03,且是疏水蛋白無跨膜區(qū)及信號肽。氨基酸序列比對結果顯示HubHLH2與其他高等植物的bHLH蛋白具有較高的同源性,說明在HLH結構域上保守程度較高,其中HubHLH2蛋白與虎耳草(Amaranthus hypochondriacus XP_010679205.1)同源性最高,達到95.9%。其次是與奎藜(Chenopodium quinoaXP_021764267.1)、甜菜(Beta vulgaris XP_010679205.1)同源性較高,為94.5%。構建系統(tǒng)發(fā)育樹結果顯示HubHLH2與擬南芥JAMs蛋白及MYC類蛋白遺傳距離較近,其中與JAM3遺傳距離最近。3.HubHLH2的組織特異性分析顯示:HubHLH2主要在根中表達,而莖和果實中相對表達量較低。該結果預示,HubHLH2可能主要在根中發(fā)揮重要的作用。用MeJA處理結果分析表明:MeJA會促進HubHLH2的表達,在1 h后的HubHLH2表達會升高,而在2 h后下降,但之后HubHLH2表達量又開始回升,在12 h達到最大值。4.以Invitrogen的Clone Miner 2 Library技術成功構建了三框型酵母cDNA文庫,其中初級文庫總克隆數(shù)達到1.44×10~7,重組率為96%,平均插入片段長度大于1 kb;次級文庫總克隆數(shù)為9.6×10~6,重組率為100%,平均插入片段長度大于1 kb;將文庫質(zhì)粒轉入Y187菌株經(jīng)鑒定文庫滴度大于3×10~7 cells/mL。5.構建pGBKT7-HubHLH2誘餌載體,將其轉入酵母Y2HOLD菌株中進行自激活作用及毒性檢測,結果表明誘餌蛋白(HubHLH2)無自激活且對酵母菌株也無毒害作用。6.采用Mating法篩選火龍果酵母文庫,初步篩選得到24個可能與HubHLH2互作的蛋白質(zhì),通過Blast比對分析發(fā)現(xiàn),篩選出的蛋白主要是與糖酵解和糖異生以及光合作用中卡爾文循環(huán)相關酶,如跨膜ATP酶、細胞色素b6f復合體、鐵氧化還原酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶等。除此之外,還發(fā)現(xiàn)HubHLH2與SPL家族基因互作,故推測HubHLH2可能除參與DNA修復、轉錄及轉錄后調(diào)控、細胞信號轉導、細胞凋亡等生命過程外,還可能由SPL基因介導調(diào)控色素合成。
【學位單位】：貴州大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：S667.9;Q943.2
【部分圖文】：

1 bHLH 基序及其目標 DNA 復合體（Ma et al，1x formed between bHLH motif and its target DNA（因子的分類等（1997）人根據(jù) bHLH 的 DNA 結合模式分為六個組分（A、B、C、D、E、F）。而 組，Buck 等（2003）從擬南芥的 147 個 b由于植物與動物中 bHLH 轉錄因子結構和生也是相對獨立的，故植物和動物中關于 beim 等（2003）在擬南芥中發(fā)現(xiàn)了 133 個 b族；隨后又出現(xiàn)了 14 個新的 bHLH 轉錄因步分成 21 個亞家族。而 Li 等（2006）則根

2.3 結果與分析2.3.1 火龍果總 RNA 質(zhì)量及反轉錄檢測采用 2.2.1.2 所述方法提取各個時期的火龍果果實的總 RNA，電泳檢測 質(zhì)量，結果（圖 2-1，A）顯示：RNA 條帶無拖尾現(xiàn)象，18S 和 28S 條帶清見，且 28S 條帶亮度約為 18S 的兩倍，這說明提取的 RNA 質(zhì)量較好，未降無 DNA 和蛋白質(zhì)的污染。用酶標儀檢測 RNA 質(zhì)量顯示 OD260/OD280 均在左右，進一步說明提取的 RNA 可以滿足后續(xù)實驗要求。將總 RNA 反轉成 c第一條鏈，并以反轉錄產(chǎn)物為模板進行擴增。獲到與預期的大小一致 167 b右的產(chǎn)物（圖 2-1，B），條帶帶型穩(wěn)定，表明反轉錄成功，可以用于下一驗。

貴州大學 2019 屆碩士研究生學位論文2.3.2 不同發(fā)育時期 HubHLHs 的 qRT-PCR 檢測本實驗中 qRT-PCR 溶解曲線和擴增曲線如圖 2-2 所示，結果顯示目的基因引物和內(nèi)參引物的溶解曲線均很平滑無波動呈單峰曲線，這說明引物的特異性很好。擴增曲線存在明顯基線期、指數(shù)期和平臺期，基線平直，各管的平行性好，表明各反應管的擴增效率十分接近。
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本文編號：2874405