水體富營養(yǎng)化和藍藻水華的發(fā)生是全球面臨的重大環(huán)境問題之一。全球范圍內藍藻水華的爆發(fā)頻率和強度日益增加,造成水體生態(tài)系統(tǒng)結構和功能的破壞和紊亂,降低水資源可利用性,影響旅游,養(yǎng)殖等行業(yè)的健康發(fā)展,也嚴重威脅人類的健康和生活。細菌在水生生態(tài)系統(tǒng)中具有十分重要的作用,是水環(huán)境中生物種群結構和功能的組成部分,與藻類生物量的平衡密切相關。因此,溶藻細菌成為微生物控藻研究的熱點。滇池是中國最大的高原湖泊,具有非常重要的生態(tài)意義和經(jīng)濟意義,但近年來頻繁遭受藍藻水華的危害。因此,本研究以滇池水華藻為研究對象,研究溶藻菌及其分泌的溶藻物質的溶藻特性與溶藻作用機制,從而為滇池藍藻水華的防治提供優(yōu)質的控藻細菌或物質資源和理論指導。主要結果如下:1.溶藻細菌的分離和鑒定。從滇池分離得到了1株高效溶藻細菌Sp34,根據(jù)其16S rRNA基因序列及系統(tǒng)發(fā)育樹分析,Sp34屬于Bacillus licheniformis。2.Bacillus licheniformis Sp34對同樣分離自滇池的銅綠微囊藻DCM4溶藻特性研究。菌株Bacillus licheniformis Sp34對初始葉綠素a濃度為2 mg/L的銅綠微囊藻的六天去除率為76%,Sp34的最低初始抑藻濃度為1.35×10~5 CFU/mL,另外對銅綠微囊藻NIES843的溶藻作用也能達到97%,表明其能高效的殺滅銅綠微囊藻。而銅綠微囊藻是一種最常見水華藍藻優(yōu)勢種,其能產生微囊藻毒素,威脅環(huán)境安全和人類健康。同時,Sp34也能抑制其它有害水華藻類的生長,包括惠氏微囊藻和席藻。因而利用Sp34作為潛在控藻資源具有重要應用價值。Sp34通過釋放胞外溶藻物質的間接方式溶藻,并且,溶藻物質可能為具有溫度和酸堿耐受性的非蛋白類物質。通過對其溶藻物質性質的研究,為后續(xù)分離純化溶藻物質提供支持和指導。3.菌株Sp34分泌的胞外溶藻物質的溶藻條件探究。24 h光照和14:10 h光暗循環(huán)的條件下,菌株Sp34無菌上清液的溶藻效果遠遠高于黑暗條件下,其溶藻作用具有一定的光依賴性。此外,28°C下,其無菌上清液的殺藻率顯著高于15°C時。同時,28℃時,藻的生長受到促進,而15℃時,藻的生長受到抑制。結合溫度和光照實驗,Sp34無菌上清液的殺藻率與銅綠微囊藻的生長顯著正相關,其產生的胞外溶藻物質的殺藻作用依賴于銅綠微囊藻的良好生長,因此,菌株Sp34或者其溶藻物質在嚴重藍藻水華的控制方面很有應用前景。4.菌株Sp34分泌的胞外溶藻物質的溶藻機制研究。Sp34無菌上清液處理后,銅綠微囊藻細胞完整性受到嚴重破壞,細胞內過氧化氫酶(CAT)活性以及丙二醛(MDA)含量顯著增加,還原型谷胱甘肽(GSH)含量顯著減少。Sp34無菌上清液可能導致藻細胞的氧化脅迫,并進一步引起藻細胞膜的脂質過氧化。此外,本研究證實了菌株Sp34分泌的胞外溶藻物質嚴重抑制了銅綠微囊藻DCM4的光合作用相關基因psaB、psbD1和rbcL的轉錄表達,DNA修復相關基因recA和微囊藻毒素合成相關基因mcyB的轉錄表達。因此,對菌株Sp34分泌的胞外溶藻物質溶解銅綠微囊藻的作用機制的初步猜測為:在芽孢桿菌Sp34分泌的溶藻物質作用下,對藻細胞造成氧化脅迫,觸發(fā)藻細胞內抗氧化機制,使得藻細胞內CAT含量升高而GSH含量降低;氧化脅迫的進一步作用下,藻細胞膜發(fā)生脂質過氧化反應,導致膜脂質過氧化產物MDA含量增加,進而導致藻細胞完整性的破壞。同時其分泌的胞外溶藻物質也對藻細胞的DNA造成損傷,影響藻細胞光合作用的正常運行,抑制藻細胞內微囊藻毒素的合成,最終殺滅藻細胞。5.溶藻物質色胺的鑒定及其溶藻特性研究。Bacillus licheniformis Sp34能在含有色氨酸的培養(yǎng)基中產生色胺。同時,Sp34的1/8 LB培養(yǎng)液中也含有色胺,色胺對銅綠微囊藻DCM4具有良好的溶藻作用,Sp34主要通過分泌胞外溶藻物質溶藻,因此推測色胺是Sp34分泌的溶藻物質之一。色胺的溶藻作用具有一定的光依賴性和溫度依賴性,結合其溫度和光照實驗,其溶藻作用依賴于銅綠微囊藻的良好生長。6.色胺溶藻機制的初步研究。色胺的作用下,藻細胞內ROS含量快速增加,藻細胞內氧化水平顯著升高,可能導致藻細胞的氧化損傷。細胞內部總蛋白和碳水化合物含量顯著下降,單個藻細胞內蛋白和糖含量增加,表明色胺可能導致藻細胞分裂受到抑制,嚴重影響藻細胞的生長,最終造成藻細胞死亡。綜上,本研究分析了一株來自滇池的高效溶藻菌及其分泌的溶藻物質對同樣分離自滇池的銅綠微囊藻的溶藻特性及溶藻機制。本研究成果將為藍藻水華的微生物治理提供控藻資源與相關理論指導。
【學位單位】：西南大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：X52;X172
【部分圖文】：

研究技術路線

下生長良好。為了進一步對 Sp34 進行鑒定，其 16S rRNA 基因序列測得后，在EZBioCloud 和 NCBI 數(shù)據(jù)庫進行 BLAST 比對，發(fā)現(xiàn)其與多株芽孢桿菌(Bacillus sp.)的相似度超過99%。根據(jù)菌株Sp34的16S rRNA基因序列構建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖2-1），結果其與地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)親緣關系最近。圖 2-1 菌株 Sp34 的系統(tǒng)發(fā)育樹Figure 2-1 Phylogenetic tree of Sp34 based on 16S rRNA gene sequences2.2.1.2 溶藻菌的生長曲線為了后續(xù)實驗的方便與統(tǒng)一，測定了溶藻菌 Sp34 的生長曲線。結果如圖 2-2所示，根據(jù)生長曲線，可以判斷出Sp34在本實驗的條件下的不同生長時期分別為：調整期（0-2 h），對數(shù)期（2-6 h），穩(wěn)定期（6-8 h）。后續(xù)實驗選擇穩(wěn)定期的菌進行（OD600值為 0.7）。

圖 2-2 Sp34 的生長曲線。Figure 2-2 Growth curve of Sp34.速判斷菌液的細胞數(shù)量，將 Sp34 菌液的 OD600值與細胞數(shù)量建-3 所示，OD600和細菌細胞數(shù)量具有良好的線性關系。后續(xù)實驗數(shù)量時，可以通過 OD600值來獲得。
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本文編號：2872408