海洋覆蓋地球表面70%以上的面積,蘊含著種類多樣、數(shù)量豐富的微生物。細菌細胞壁肽聚糖是海洋中顆粒有機質(zhì)(particulate organic matter,POM)的重要組分。D型丙氨酸(D-alanine,D-Ala)是肽聚糖的關鍵組分,二氨基庚二酸(diaminopimelic acid,DAP)是革蘭氏陰性細菌肽聚糖的特征性組分。海洋環(huán)境中,微生物利用D-Ala和DAP的機制,以及能夠利用DAP細菌的種類,目前研究并不清楚。Pseudoalteromonas sp.CF6-2是本實驗室從深海沉積物中分離得到的一株可以降解革蘭氏陽性菌肽聚糖并能以釋放出的D-Ala為唯一氮源生長的菌株。本文對推定的CF6-2利用D-Ala的代謝通路中的三個關鍵酶進行了異源表達和純化,并對它們進行了體外功能驗證與表征。DAP是革蘭氏陰性細菌肽聚糖的特征性組分。本文對西太平洋多個位點不同深度的海水樣品中能利用DAP為唯一碳氮源的細菌進行了多樣性分析,并從中篩選出了 45株能利用DAP的菌株;本文還分析了其中2株菌株利用DAP的代謝通路。1.深海細菌Pseudoalteromonas sp.CF6-2利用D-Ala代謝通路中關鍵酶的體外功能驗證與表征前期研究表明,Ps.sp.CF6-2分泌的彈性蛋白酶pseudoalterin能裂解革蘭氏陽性菌肽聚糖中D-Ala兩端的肽鍵,釋放D-Ala,并能以D-Ala為唯一氮源生長。基因組與轉(zhuǎn)錄組分析表明,在Ps.sp.CF6-2利用D-Ala的代謝通路中,D-Ala連接酶0208、Ala消旋酶3059和D-Ala氨基轉(zhuǎn)移酶1756可能起到關鍵作用。本文對這這些酶的功能進行了體外驗證,并對它們進行了表征。D-Ala對于細菌通常具有毒性。我們測定了 Ps.sp.CF6-2以不同濃度的D-Ala為唯一氮源的生長情況,結果表明Ps.sp.CF6-2雖然可以利用D-Ala為唯一氮源生長,但高濃度的D-Ala對Ps.sp.CF6-2的生長仍具有抑制作用,表明Ps.sp.CF6-2利用低濃度D-Ala時可能會先將其轉(zhuǎn)化為其他物質(zhì)以對抗其毒性。我們對推定的Ps.sp.CF6-2利用D-Ala的關鍵酶D-Ala連接酶0208、Ala消旋酶3059和D-Ala氨基轉(zhuǎn)移酶1756進行了異源表達和純化,然后通過體外酶活測定實驗驗證了它們利用D-Ala的功能,證明D-Ala連接酶0208可以將D-Ala互相連接成為D-Ala-D-Ala二肽,Ala消旋酶3059可以將D-Ala和L-Ala互相轉(zhuǎn)化,D-Ala氨基轉(zhuǎn)移酶1756可以將D-Ala脫氨為丙酮酸,為推定的Ps.sp.CF6-2的D-Ala代謝通路提供了證據(jù)。我們還測定了上述酶的米氏曲線等表征。2.西太平洋水樣中利用二氨基庚二酸菌株的篩選及多樣性分析我們以DAP為唯一碳氮源,對西太平洋A1、A3、A4、A10、B3位點不同深度共16個海水樣品進行了富集培養(yǎng),分析了西太平洋水樣中能利用DAP為唯一碳氮源的細菌的多樣性,發(fā)現(xiàn)西太平洋表層和淺層海水樣品中能利用DAP為唯一碳氮源的細菌以Thalassospira、Erythrobacter和Haloryionas為主,而深層海水樣品中以Alteromonas、Pseudoaltemomonas、Microbacterium、Thalassospira和Nitratireductor為主。我們使用DAP篩選平板從上述位點的海水樣品中篩選出了45株能利用DAP的菌株。3.西太平洋細菌利用二氨基庚二酸的代謝通路研究為了闡明海洋細菌利用DAP的機制,我們選取了2株能利用DAP為唯一碳氮源生長較快的菌株,其中1株革蘭氏陽性,1株革蘭氏陰性,對它們進行了基因組測序。通過對它們基因組中基因注釋的分析,查閱相關的酶學數(shù)據(jù)庫,推測它們主要通過兩條途徑利用DAP:使用diaminopimelate decarboxylase將DAP轉(zhuǎn)化為賴氨酸,然后進入檸檬酸循環(huán);或使用UDP-N-acetylmuramoyl-L-alanyl-D-glutamate--2,6-diaminopimelate ligase和UDP-N-acetylmuramoyl-tripeptide-D-alanyl-D-alanine ligase將DAP連接到連接在乙�；系亩屉纳�,生成的UDP-N-acetylmuramoyl-L-alanyl-D-glutamyl-meso-2,6-diaminopimeloyl-D-alanyl-D-alanine是革蘭氏陰性菌細胞壁DAP型肽聚糖的重要原料,可以直接被陰性菌用于自身細胞壁肽聚糖的合成。本論文研究結果初步揭示了海洋細菌代謝D-Ala和DAP的機制,對闡明海洋中細菌驅(qū)動的D-Ala和DAP的生物地球化學循環(huán)機制具有重要意義。
【學位單位】：山東大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：Q936
【部分圖文】：

放并利用Ｄ－Ａｌａ；并通過基因組和轉(zhuǎn)錄組分析，推測出Ｄ－Ａｌａ在ｓｐ．?ＣＦ６－２??代謝通路中的關鍵酶：Ｄ－Ａｌａ連接酶０２０８、Ａｌａ消旋酶３０５９和Ｄ－Ａｌａ氨基轉(zhuǎn)移??酶１７５６?（Ｙａｎｇ，２０１７）（圖１－２）。但這些酶的活性與功能尚未驗證。??１６??

０１２３４５６７８??Ｔｉｍｅ?（Ｄａｙ）??圖２－１以不同濃度Ｄ－Ａｌａ為唯一氮源培養(yǎng)ＣＦ６－２時的生長情況。??Ｆｉｇｕｒｅ?２－１．?Ｇｒｏｗｔｈ?ｏｆ?ＣＦ６－２?ｗｉｔｈ?Ｄ－Ａｌａ?ｏｆ?ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ?ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ?ａｓ?ｓｏｌｅ?ｎｉｔｒｏｇｅｎ?ｓｏｕｒｃｅ．??ＣＦ６－２?ｉｎ?Ｃｏｎｔｒｏｌ??ＣＦ６－２?ｉｎ?２?ｍＭ?Ｄ－Ａｌａ??ｊ?ＪＪｇ?ＣＦ６－２?ｉｎ?４?ｍＭ?Ｄ－Ａｌａ??０１８：?ＣＦ６－２?ｉｎ?６?ｍＭ?Ｄ－Ａｌａ??ＣＦ６－２?ｉｎ?１０?ｍＭ?Ｄ－Ａｌａ??ＣＦ６－２??ＣＦ６－２?２０?ｍＭ??〇?０．０８－??〇．〇ｅ：??０．００?丄ｎ?＾???７．２?７．４?７．６?７．８?８．０??Ｔｉｍｅ?（Ｄａｙ）??圖２－２?ＣＦ６－２以不同濃度Ｄ－Ａｌａ為唯一氮源生長１８４

圖２－１以不同濃度Ｄ－Ａｌａ為唯一氮源培養(yǎng)ＣＦ６－２時的生長情況
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本文編號：2867219