小麥內(nèi)質(zhì)網(wǎng)氧化還原酶(wEro1)具有顯著提高面粉加工品質(zhì)的能力,有望成為提高面粉筋力的新型生物改良劑。但其用于工業(yè)生產(chǎn)應(yīng)用,仍有一定的局限性。受催化效率、表達(dá)量、穩(wěn)定性等限制,生產(chǎn)成本相對(duì)較高。本文以wEro1為研究對(duì)象,在對(duì)野生型wEro1的基本性質(zhì)進(jìn)行探討的基礎(chǔ)上,通過理性設(shè)計(jì)對(duì)其進(jìn)行分子改造,最終獲得了活性得到提升的正向突變體。同時(shí),利用畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)了野生型wEro1,經(jīng)優(yōu)化后實(shí)現(xiàn)了wEro1的異源高效表達(dá)。主要研究內(nèi)容:(1)wEro1基本性質(zhì)的測(cè)定。大腸桿菌重組wEro1的比酶活為201.35±14.37 U/mg;最適反應(yīng)pH為7.5,最適反應(yīng)溫度為35℃;在低溫和中性條件下穩(wěn)定性較好;Cu~(2+)等金屬離子對(duì)wEro1表現(xiàn)出明顯的抑制作用;SDS、Tween-20和Triton X-100對(duì)wEro1的活性都表現(xiàn)出一定的抑制作用。(2)wEro1的分子改造。以序列同源性分析和同源建模結(jié)構(gòu)為指導(dǎo),通過理性設(shè)計(jì),選擇了處于活性位點(diǎn)或活性調(diào)控相關(guān)的9個(gè)半胱氨酸殘基進(jìn)行定點(diǎn)突變,應(yīng)用重疊延伸PCR技術(shù)實(shí)現(xiàn)了9個(gè)半胱氨酸殘基的定點(diǎn)突變,進(jìn)一步構(gòu)建了重組突變型wero1基因的原核表達(dá)載體。(3)正向突變體的篩選。在大腸桿菌表達(dá)體系中,成功可溶表達(dá)了8個(gè)突變型重組wEro1,篩選得到了5個(gè)活性得到提升的正向突變體,分別是:C105A(wEro1的第105位半胱氨酸殘基突變?yōu)楸彼釟埢?、C124A、C149A、C220A和C229A,其中,活性增加最為明顯的是C220A和C105A,分別增加了119.64%和101.74%的活性。(4)wEro1在畢赤酵母中的高效表達(dá)。成功構(gòu)建了wEro1的真核表達(dá)載體pPICZαA-wero1,并實(shí)現(xiàn)了其在畢赤酵母GS115中的表達(dá)。通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)優(yōu)化了表達(dá)條件,優(yōu)化后其表達(dá)量可達(dá)53.24?2.11 U/mL。等體積發(fā)酵液下,畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)量是大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)量的14.7倍,實(shí)現(xiàn)了wEro1的高效表達(dá)。
【學(xué)位單位】：華南理工大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：Q78
【部分圖文】：

圖 1-1 Ero1 催化二硫鍵形成示意圖ure 1-1 Pathway of Ero1 catalyzed the formation of disulfide 源的 Ero1 均含有多對(duì)二硫鍵，其中兩對(duì)構(gòu)成了高度保守Ero1 催化氧化過程中的電子轉(zhuǎn)移（圖 1-2）[18]。內(nèi)活性位間位置上靠近核心催化區(qū)域的輔基 FAD 分子，方便其中被氧化成二硫鍵。外活性位點(diǎn)包含 C-X-X-X-X-C 基序，無規(guī)卷曲（LoopⅠ）上[4]，主要承擔(dān)將底物半胱氨酸殘基的6]。

圖 1-1 Ero1 催化二硫鍵形成示意圖e 1-1 Pathway of Ero1 catalyzed the formation of disulfid的 Ero1 均含有多對(duì)二硫鍵，其中兩對(duì)構(gòu)成了高度保守o1 催化氧化過程中的電子轉(zhuǎn)移（圖 1-2）[18]。內(nèi)活性位位置上靠近核心催化區(qū)域的輔基 FAD 分子，方便其中氧化成二硫鍵。外活性位點(diǎn)包含 C-X-X-X-X-C 基序規(guī)卷曲（LoopⅠ）上[4]，主要承擔(dān)將底物半胱氨酸殘基的。

第一章 緒論高活性狀態(tài)，產(chǎn)生過量過氧化氫損傷細(xì)胞[19]，然而不同來源 Ero1 的活性反是不一樣的。酵母源 Ero1 的催化機(jī)制母源 Ero1 的主體結(jié)構(gòu)由十個(gè) α 螺旋組成，核心區(qū)域上方覆蓋了由上百個(gè)氨成的柔性無規(guī)卷曲（Loop Ⅰ）[5]，其立體結(jié)構(gòu)如圖 1-3 所示。它一共有 14 個(gè)基，其中 10 個(gè)在這段無規(guī)卷曲上或在無規(guī)卷曲與核心區(qū)域的連接上[1]。只有酸殘基是維持其活性所必須的，這 4 個(gè)半胱氨酸殘基可形成兩對(duì)二硫鍵：C內(nèi)活性位點(diǎn)）和 C100-C105（外活性位點(diǎn)）[20]。C352-C355 位于其輔基 FA00-C105 位于非常靈活的無規(guī)卷曲 Loop Ⅰ上。在氧化 PDI 的過程中，C100-C收底物的電子并將電子轉(zhuǎn)移給C352-C355，C352-C355再將電子轉(zhuǎn)移給輔基F將電子轉(zhuǎn)移給氧分子，整個(gè)過程伴隨著氧氣的消耗和過氧化氫的產(chǎn)生[4]。
【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前3條

1 王建偉;溫成志;劉全偉;;巰基氧化酶在國產(chǎn)面包粉中應(yīng)用的初探[J];糧食加工;2010年03期

2 蔡盡忠;;影響外源基因在巴斯德畢赤酵母表達(dá)的因素[J];海峽藥學(xué);2006年06期

3 趙玉蓉,金宏,陳清華,王紅權(quán),沈維軍,朱立濤;金屬離子對(duì)飼料酶活性的影響[J];飼料研究;2004年08期

相關(guān)博士學(xué)位論文 前1條

1 劉光;重組小麥內(nèi)源酶wPDI和wErol影響面粉加工品質(zhì)機(jī)理的研究[D];華南理工大學(xué);2017年

本文編號(hào)：2859174