�；o酶A結(jié)合蛋白(Acyl-CoA-bindingproteins,ACBPs)是一類脂類載體蛋白,具有結(jié)合和運輸脂類物質(zhì)的功能,在植物生長發(fā)育和逆境(低溫、氧化、干旱和重金屬)應(yīng)答調(diào)控過程中發(fā)揮了重要作用。但其在植物鹽堿脅迫應(yīng)答中的作用未見報道。星星草(Puccinellia tenuiflora 是一種單子葉禾本科鹽生植物,是研究植物鹽堿應(yīng)答機制的理想模式植物。本研究,利用分子遺傳學(xué)技術(shù)從星星草中克隆到PutACBP1基因,其開放閱讀框為981 bp,編碼326個氨基酸。PutACBPl是ACBP家族Class II亞族的成員之一,含有一個ACB結(jié)構(gòu)域和Ankyrin結(jié)構(gòu)域。熒光定量PCR分析表明,PutACBP1基因在星星草根、莖、葉、葉鞘、花、穗和種子均有表達(dá),在葉中的表達(dá)量最高,在莖中表達(dá)量最低。在逆境(200 mmol/L NaCl、100 mmol/L NaHCO3、75 mmol/L Na2C03 脅迫、160 μmol/L CdCl2、10 mmol/L H2O2 和 4℃)脅迫時,根和葉中的PutACBP1都受誘導(dǎo)表達(dá)。這暗示著PutACBP1可能參與了鹽堿、氧化、重金屬和低溫脅迫的應(yīng)答過程。煙草(Nicotiana tabacum L.)葉片細(xì)胞和擬南芥(Arabidopsis thaliana)葉片細(xì)胞中定位分析表明,正常條件下PutACBP1定位于在細(xì)胞質(zhì)。通過PutACBP1基因原核表達(dá)體系,誘導(dǎo)并純化到(His)6-PutACBP1融合蛋白,利用磷脂結(jié)合實驗初步證實了 PutACBP1具有與磷脂酰膽堿(Phosphatidylcholine,PC)結(jié)合的能力。通過構(gòu)建pBI121-PutACBP1重組質(zhì)粒,并利用農(nóng)桿菌侵染法分別獲得PutACBP1過表達(dá)擬南芥植株。對轉(zhuǎn)PutACBP1基因擬南芥植株的耐鹽性分析表明,在100 mmol/L和125 mmol/L NaCl脅迫下,過表達(dá)PutACBP1基因擬南芥的根長和鮮重都優(yōu)于野生型擬南芥。擬南芥同源基因AtACBP2突變體植株(SALK-023077)的耐鹽性分析表明,在100 mmol/L和125 mmol/L NaCl脅迫下,突變體擬南芥植株的根長和鮮重都低于野生型擬南芥。綜上所述,在逆境應(yīng)答過程中,PutACBP1對于植物鹽脅迫應(yīng)答具有正調(diào)控作用。同時PutACBP1可能通過與磷脂酰膽堿結(jié)合調(diào)控其運輸?shù)劫|(zhì)膜,參與植物的脂類代謝。這些結(jié)果為深入研究星星草PuACBP1基因鹽堿應(yīng)答分子調(diào)控機理提供了新的證據(jù)。
【學(xué)位單位】：東北林業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：Q943.2
【部分圖文】：

１．?ＰｗＭＣ及Ｐｉ基因ｃＤＮＡ全長擴増??以星星草葉片ｃＤＮＡ為模板，用ＰｕｔＡＣＢＰｌ－Ｆ、ＰｕｔＡＣＢＰｌ－Ｒ引物進(jìn)行ＰＣＲ擴增，得??到１０００?ｂｐ左右的片段（圖３－１）。經(jīng)過連接與轉(zhuǎn)化，得到重組質(zhì)粒，經(jīng)過雙酶切鑒定后??進(jìn)行測序（圖３－２）。測序結(jié)果所示，ＯＲＦ包括９８１?ｂｐ，編碼３２６個氨基酸（圖３－３）。??Ｍ?１??２０００ｂｐ??ｌｏｏｏｂｐ?ｍｒｎ＿＾ｉｍｈ＾??■??圖３－１?Ｐｉ／ＭＣＳＷ基因全長ｃＤＮＡ的ＰＣＲ擴增??Ｍ：Ｍａｒｋｅｒ?ＤＬ２０００；?ｌ．ＰＣＲ?擴增的?ＰｕｔＡＣＢＰｌ?基因全長??Ｆｉｇ．?３－１?ＰＣＲ?ｐｒｏｄｕｃｔ?ｏｆ?ＰｕｔＡＣＢＰｌ?ｆｕｌｌ?ｌｅｎｇｔｈ?ｃＤＮＡ??Ｍ：Ｍａｒｋｅｒ?ＤＬ２０００；?１．?ＰＣＲ?ｐｒｏｄｕｃｔ?ｏｆ?ＰｕｔＡＣＢＰｌ??Ｍ，?１?２?３?４?Ｍ２??…「?＇翻??３０００ｂｐＨｕＫ＜?壩??２〇〇〇ｈｐｆｅ－?」Ｍｌ）ｈＰ??議?；?Ｉ：＇?：；?Ｉ??圖?３－２?酶切鑒定?ｐＥＡＳＹ－Ｂｌｕｎｔ－Ｐ？ＭＣ＾Ｗ??Ｍｉ：Ｍａｒｋｅｒ?ＤＬ５０００；?Ｍ２：Ｍａｒｋｅｒ?ＤＬ２０００；?１－４．ＰＣＲ?擴增的?尸７?基因

９６１?ＴＴＣＡＴＧＡＡＣＣＴＧＧＣＴＡＡＣＴＧＡ??３２１?Ｆ?＼！?Ｎ?ＬＡＮ＊??圖３－３?ＰｗＭＣＭＪ基因及其編碼的氨基酸序列??Ｆｉｇ．３－３?ＯＲＦ?ｏｆ?ＰｕｔＡＣＢＰｌ?ａｎｄ?ｔｈｅ?ａｍｉｎｏ?ａｃｉｄ?ｓｅｑｕｅｎｃｅ??２．?基因全長的核苷酸序列分析??利用ｐｒｏｔｐａｒａｍ軟件分析，ｃＤＮＡ基因全長９８１ｂ?ｂｐ，含有３２６個氨基酸殘基的蛋白??質(zhì)，ＰｕｔＡＣＢＰｌ蛋白分子式為Ｃ２８４５Ｈ４７ｉｉＮ９８１Ｏ１１６０Ｓ２９６，蛋白分子量為８０７０９．３４Ｄａ，理論等??電點為５．０１。不穩(wěn)定系數(shù)為５１．１６，屬于不穩(wěn)定蛋白。利用軟件ＳＭＡＲＴ（ｈｔｔｐ：／／ｓｍａｒｔ．ｅｍｂｌ－??ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ．ｄｅ／）分析表明該蛋白質(zhì)含有一個ＡＣＢ結(jié)構(gòu)域和一個ＡＮＫ結(jié)構(gòu)域（圖３－４Ａ）。??利用軟件ＴＭＨＭＭ?（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＴＭＨＭＭ／）對該蛋白質(zhì)預(yù)測跨膜結(jié)構(gòu)

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本文編號：2850571