酶是一種能夠催化特定化學反應的生物催化劑。因其溫和的反應條件、對底物的專一性和高效率的催化活性,已在諸多工業(yè)領域廣泛應用。然而,對植物來源的酶或是微生物來源的酶來說,將其從復雜的體系中分離出來的同時又要防止其結構的改變以及生物活性的喪失,一直是其分離純化過程中的關鍵問題。雙水相浮選技術作為一種復合型分離技術,具有純化步驟簡易、操作環(huán)境溫和和易于放大等優(yōu)點,因而被逐漸引入到對生物制品的分離純化中。本文以菠蘿蛋白酶和融合β-葡萄糖苷酶為例,構建新型的雙水相浮選體系對酶進行分離純化,具體內(nèi)容如下:(1)設計合成了溫敏聚合物L64-IDA-Cu(Ⅱ)作為浮選捕集劑,并利用FT-IR、原子吸收光譜法和透射率實驗對其結構和溫敏性能進行研究。通過考察一系列離子液體(IL)和鹽對菠蘿蛋白酶的酶活穩(wěn)定性影響,構建[Bmim]Br-K2HPO4的離子液體雙水相浮選(ILATPF)體系,并以L64-IDA-Cu(Ⅱ)為捕集劑結合ILATPF對菠蘿蛋白酶進行分離純化。通過單因素實驗和響應曲面法(RSM)優(yōu)化得到實驗條件:鹽濃度,浮選時間,L64-IDA-Cu(Ⅱ)濃度,IL濃度和浮選流速分別為0.50 g/mL,30min,0.30g/L,60%和30mL/min,并得出最佳浮選效果:Ye和Kp值分別達到97.43%和3.45。對于浮選分離后得到的L64-IDA-Cu(Ⅱ)-菠蘿蛋白酶復合物以及上相離子液體的混合物,利用L64-IDA-Cu(Ⅱ)的溫敏性能,通過兩步沉淀去除離子液體和L64-IDA-Cu(Ⅱ)本身,實現(xiàn)最終純化(得到的菠蘿蛋白酶的Ye、Kp和PF值為96.90%、5.97和7.18)。接著將本實驗方法與其他純化方法進行比較,證明本實驗方法具有良好的純化效果。最終通過SDS-PAGE分析,證明純化的菠蘿蛋白酶的純度優(yōu)良,并用紫外吸收光譜分析(UV-vis)、FT-IR和圓二色譜(CD)驗證純化過程對菠蘿蛋白酶的結構沒有造成影響。(2)本實驗成功表達了含GB和ELP標簽的融合β-葡萄糖苷酶(Glu):Glu-linker-ELP-GB(GLEGB)。通過考察一系列聚合物、鹽和表面活性劑對Glu的酶活穩(wěn)定性影響,構建了 PEG-(NH4)2SO4的ATPF體系。然后利用融合蛋白GLEGB上的GB標簽的疏水作用結合ATPF對融合蛋白進行初步純化。通過單因素實驗和RSM優(yōu)化得到ATPF純化GLEGB的條件:PEG 2000濃度,BS-12濃度,浮選時間和浮選流速分別為40.00%,1.50%,30 min和30 mL/min,并得到最佳的浮選效果:Ye和PF值分別為172.86%和9.58。然后對于得到的GLEGB和PEG2000的混合液,利用GLEGB上的ELP標簽的逆轉換循環(huán)(ITC)特性去除PEG 2000,得到進一步純化的GLEGB水溶液(純化的GLEGB的Ye和PF值達到 124.92%和24.26)。并將ATPF-ITC聯(lián)用方法用于其他酶(Glu、Glu-linker-ELP(GLE)、Glu-linker-GB(GLG)、Glu-linker-ELP-6His(GLEH))的分離純化,證明了GB和ELP標簽聯(lián)用的良好純化效果。最后通過SDS-PAGE分析,證明純化的GLEGB的純度良好,并通過UV-vis、FT-IR和CD對購買的Glu和純化的GLEGB進行比較,驗證純化過程對酶的結構沒有造成影響。
【學位單位】：江蘇大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：Q814.1
【部分圖文】：

置：1. 氣體鋼瓶 2. 轉子流量計 3.浮選池ublation apparatus: 1. Gas cylinder; 2. Pin-tycell; 4. Glass sand filter board 5. Outlet valv直接通氣來進行浮選，氣體主要由壓，比如空氣、氦氣和氮氣等，本實驗瓶上的不同閥門，靠它們控制氣體壓體流速，常用的是轉子流量計和皂膜量計。浮選柱根據(jù)各自需求進行定制用 G3 或 G4 的玻砂濾板，從而使通入。本實驗采用的是玻璃材質(zhì)，容量為 個裝置之間由橡皮管進行連接。

和的氣泡傳質(zhì)進行質(zhì)量傳遞，從而可有效抑制乳化現(xiàn)象；件溫和：整個過程不使用有機溶劑，體系生物相容性好，比 PEG 和 Dex 不僅無毒，而且還可以用作蛋白質(zhì)的穩(wěn)定劑；作簡單：雙水相浮選設備簡單，投資小，并可根據(jù)處理樣品浮選柱，同時易于連續(xù)化操作。相浮選的基本原理 主要基于目標物在氣泡上的吸附，并由氣泡傳遞轉移進入浮選。經(jīng)過不斷演變，Valsaraj[13]建立了相對完整的浮選模型(如型闡述：目標物在浮選體系中主要通過三種途徑在兩相之間物吸附或隨捕集劑共同吸附到氣泡上，并隨氣泡轉移至上相進行物質(zhì)轉移，主要是依賴濃差擴散；三是目標物通過氣泡表作用進行物質(zhì)轉移，其中部分目標物又隨小液滴返回至水相

型號 DF-101S 河南省鞏義予TGL-16aR 上海安Nicolet Nexus 470 美國PHS-3C 上海精密BS 124S 賽多利斯UV-2450 日KQ-250B 101 昆山市超DZF 6020 河南省鞏義予DHG-9145A 上海一恒/ 行，氣泡由氮氣經(jīng) G4 玻砂濾板體流速，裝置如圖 2.1 所示。
【參考文獻】

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本文編號：2849774