分生組織的發(fā)育會影響植物的形態(tài)建成,而植株形態(tài)會極大影響園林植物的群落配置與景觀效果。為促進沙柳(Salixpsammophila)的分子定向育種,研究其基因調(diào)控機理,本研究利用同源克隆技術(shù)克隆獲得沙柳SpsLAS2、SpsLAS3基因并做生物信息學(xué)及組織特異性表達分析,構(gòu)建35s::SpsLAS2與35s::SpsLAS3超量表達載體。通過Sitefinding-PCR技術(shù)克隆SpsLAS2基因的5'調(diào)控區(qū)序列片段并做序列分析。具體研究結(jié)果如下:1.通過同源克隆技術(shù)獲得沙柳SpLAS2與SpsLAS3基因的CDS序列,研究發(fā)現(xiàn)SpsLAS2和SpsLAS3基因序列相似性達96.69%,氨基酸序列相似性達97.6%。SpsLAS2和SpsLAS3基因ORF長分別為1248、1254 bp,分別編碼415和417個氨基酸殘基。其氨基酸序列具有 GRS(GIBBERELLIN-INSENSITIVE,REPRESSOR of ga1-3,SCARECROW)基因家族典型的五個結(jié)構(gòu)域[1],屬LS亞家族。2.同源蛋白序列比對與系統(tǒng)進化樹構(gòu)建表明,沙柳SpsLAS2、SpsLAS3蛋白序列與歐洲紅皮柳親緣關(guān)系最近,其次是毛果楊,而與草本類植物基因差異較大。3.通過對沙柳SpsLAS2、SpsLAS3基因的組織特異性表達結(jié)果分析,可知沙柳SpsLAS2基因在葉腋處的表達量最高,然后在韌皮部、成熟葉、莖、根、側(cè)頂芽、頂芽依次降低。沙柳SpsLAS3基因也在葉腋處表達量最高,然后在成熟葉、側(cè)頂芽、頂芽、根、莖、韌皮部依次降低。4.通過酶切產(chǎn)物與35S超量表達載體pMDC32的LR反應(yīng)構(gòu)建兩基因的超量表達載體,經(jīng)含Kana的LB培養(yǎng)基篩選、菌落PCR及測序,表明SpsLAS2與SpsLAS3兩基因構(gòu)建超量表達載體成功。5.以沙柳基因組DNA為模板,利用SiteFinding-PCR技術(shù)克隆獲得了一段長度為501bp的SpsLAS2基因5'調(diào)控序列。利用SOGO等在線軟件對該序列進行預(yù)測與分析發(fā)現(xiàn),該基因5'調(diào)控區(qū)存在一個可能的啟動子,除具有基本的啟動子元件CAAT-BOX外,還包含一些典型的光響應(yīng)元件、激素應(yīng)答和脅迫誘導(dǎo)相關(guān)的順勢作用元件。由此推斷SpsLAS2基因的表達可能受光、低溫、赤霉素等因素的調(diào)控。
【學(xué)位單位】：內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：Q943.2;S793.9
【部分圖文】：

Ｎ端高度變異，有一定多樣性，參與不同信號轉(zhuǎn)換，決定蛋白功能特異性，而??（：端高度保守。０１１八３蛋白一般包含［］１１、乂１￣［１１０、０１１［、？［丫１＾、３八＼￥５個高??度保守的結(jié)構(gòu)域（如圖１）［６２］。ＶＨＩＩＤ為蛋白核心結(jié)構(gòu)，在所有ＧＲＡＳ蛋白家族中幾??乎都存在。ＬＲＩ和ＬＲＩＩ對稱分布于ＶＨＩＩＤ兩邊，均為約１００個亮氨酸組成的亮氨??酸豐富區(qū)。ＬＲＩ包含一個核信號區(qū)，具有典型ＲＸ１１（Ｘ１１：?１１個任意氨基酸殘基）Ｒ??區(qū)。ＬＲｉｒ包含ＬＸＸＬＬ＾Ｓ，［＿］。ＰＦＹＲＥ基序通常含有脯氨酸（Ｐ）、苯丙氨酸（Ｆ）、酪??氨酸（Ｙ）、精氨酸（Ｒ）和谷氨酸（Ｅ）五種氨基酸殘Ｓ［６２＿＇ＳＡＷ基序由ＷＸ７Ｇ（Ｘ７：７個??任意氨基酸殘基）、Ｌ－Ｗ和ＳＡＷ三個連續(xù)部分組成％６５１。??ｖａｒｉａｂｌｅ?ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ??ｉｍｉ?Ｌ?ｒｉｃｈ?Ｉ?Ｌ－ｒｉｃｈ?Ｐ＿Ｅ?ｌ?ＳＡＷ??ＶＨＩＩＤ?ＲＶＥＲ??圖１?ＧＡＲＳ蛋白分子結(jié)構(gòu)［６２］??Ｆｉｇ?．１?Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ?ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ?ｏｆ?ＧＡＲＳ?ｐｒｏｔｅｉｎ［６２］??

Ｂｏｌｌｅ［６６］等對模式植物擬南芥和水稻的基因家族進行進化分析，將Ｇ兄４５??基因家族劃分為８個亞家族：Ｌ／ＳＣＸ、別７７、ＳＣｉ３、Ｚ）￡ＸＺ＾、Ｓｄ?＊Ｓ７／ｉ？、ｉ＾和／ＭＭ??（如圖２）。他＾＾［６７］等通過進化樹分析將０反八３基因家族分為１３個亞家族乂＿７７、??ＡｔＳＣＬ４／７、ＡｔＳＣＬ９、ＡｔＳＨＲ、ＨＡＭ、ＡｔＬＡＳ、ＡｔＳＣＲ、Ａ－ｔＳＣＬ３、ＡｔＳＣＬ２８、ＤＥＬＬＡ、??尸ｄ?ＯＭ和付。其研究結(jié)果表明不同植物中基因家族序列存在高度相??似性，這表明該家族在植物中可能是通過串聯(lián)復(fù)制產(chǎn)生重復(fù)基因而進行進化的。由??于序列高度保守，同一亞家族成員在功能上也具有相似性或相關(guān)性。??—ｒ？纖＂ｄｉｍ念｛５】於??一―—二…?，＾?１?■歲?Ａｔ?????????????．．．．．．－ｐ：：＝ｚ：ｒｒ：??ｒ－———?＆￣ｃｒｒｚ?ｉｔ?ＳＳ??＇?｛?４??ｉ＊獅哪料．：ｐ雄．＊貧??一卿—一？ｎ￡＾ｃｒ＝??ｒ———————屬｜￡??＇１．…—Ｉ?＾?ｊｒＵＩ－－ｃｚｚｚ??ｌ￣ｎ?ｒ??ｔｍ??ｉ＾ｃｚｒ：念雜??Ｍｇ＾ｊＬＪｋ?緣?Ｉ?ｌ…．．－???…＇『一一＜？麵務(wù)??－?１?．“、＞？、—??Ｌ．．．．，，，，．．．，．，＾ＷＯａ－＾??－．一一一．．．???一ｒ°—？？＂？＊＊＊?？〇？＃???—?？＾Ｐ１＇??ｆ＿＿纖＾＾娘??ｘｍｕｕ＾一????＾，ｒ－＾Ｃ：?－：：？：?ＳＳ??瞻?Ｌ??ｉ?「￣？Ｍ＝ｎＳｓｉ??—?＊?￣７＝＝ｍ

采用?Ｔｈｅｒｍｏ?Ｆｉｓｈｅｒ?公司生產(chǎn)的?ＧｅｎｅＪＥＴ?Ｐｌａｎｔ?ＲＮＡ?Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ?Ｋｉｔ?試劑盒進行??沙柳總ＲＮＡ的提取。采用紫外分光光度計進行濃度檢測，濃度為２７７８?ｎｇ／ｐｌ電泳結(jié)??果顯示２８?ｓ條帶亮度約是１８?ｓ處的兩倍（如圖３），說明ＲＮＡ提取質(zhì)量較好。??１??２８ｓ—ｉ，??１８ｓ—??—??圖３沙柳總ＲＮＡ電泳圖??Ｆｉｇ．３?Ｔｏｔａｌ?ＲＮＡ?ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｏｇｒａｍ?ｏｆ?Ｓａｌｉｘ?ｐｓａｍｍｏｐｈｉｌａ??３．?１．２設(shè)計及測試引物結(jié)果??提取沙柳全株ＲＮＡ并進行ｃＤＮＡ第一鏈的合成，以ｃＤＮＡ第一鏈為模板，利??用所設(shè)計的５’端ＵＴＲ區(qū)引物與３＇端ＵＴＲ區(qū)引物，在２０?｜ｉｌ?Ｐｆｕ高保真酶體系下進行??ＰＣＲ的擴增，得到目標條帶，利用Ｔｒａｎｓ２Ｋ?ＤＮＡ?Ｍａｒｋｅｒ進行長度判斷，目標條帶??為預(yù)估約為１５００?ｂｐ左右，實際亮度條帶在１０００?ｂｐ與２０００?ｂｐ之間，約為１５００?ｂｐ??符合預(yù)估條件（如圖４）。??Ｍ?１??２?ｏｏｏｂ?ｐ??滅＿??圖４目標基因擴增電泳檢測??Ｆｉｇ．?４?Ｅｌｅｃｔｒｏｆｈｏｒｅｓｉｓ?ｐａｔｔｅｒｎ?ｏｆ?ｔａｒｇｅｔ?ｇｅｎｅ??
【參考文獻】

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本文編號：2841070