β-丙氨酸是自然界中唯一的β型氨基酸,其作為重要的中間體,廣泛被應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、化工等領(lǐng)域。與目前運(yùn)用較多的化學(xué)法生產(chǎn)β-丙氨酸工藝相比,生物法工藝條件溫和,特異性強(qiáng),環(huán)境污染較少,具有重要的工業(yè)應(yīng)用前景以及研究價值。L-天冬氨酸-α-脫羧酶(L-aspartate-α-decarboxylase,EC4.1.1.11,PanD)能夠催化L-天冬氨酸脫羧生成β-丙氨酸。但是目前PanD酶活較低,且丙酮�；蕾囆兔擊让笗霈F(xiàn)機(jī)理性反應(yīng)失活現(xiàn)象,所以研發(fā)高活性和穩(wěn)定性的新型L-天冬氨酸-α-脫羧酶,是β-丙氨酸工業(yè)化生產(chǎn)中的基礎(chǔ)。本論文選擇昆蟲赤擬谷盜(Tribolium castaneum)來源的L-天冬氨酸-α-脫羧酶(TcPanD)基因在大腸桿菌(Escherichia coli)BL21(DE3)中重組表達(dá)。運(yùn)用蛋白質(zhì)工程手段對酶基因進(jìn)行分子改造,以提高其酶活力和催化穩(wěn)定性。研究結(jié)果如下:1、建立包含3500個突變子的TcPanD突變體文庫,篩選得到兩個催化活力顯著提高的突變體16-H5和18-G6,突變位點(diǎn)分別是R98H、K351E、I451V,酶活分別是原始TcPanD酶活的1.61倍和1.43倍。定點(diǎn)飽和突變及分析確定了突變體的最佳氨基酸組合方式,替換的氨基酸分別是R98H和K351S,并將其命名為TcPanD-R38H/K305S。通過對TcPanD進(jìn)行同源建模,顯示突變的氨基酸位置位于表面位置的無規(guī)則卷曲處,通過分子對接分析推測遠(yuǎn)離底物L(fēng)-天冬氨酸的高酶活突變位點(diǎn)R98可能是通過一定的作用力參與了結(jié)構(gòu)穩(wěn)定�？拷麹-天冬氨酸的突變位點(diǎn)K305可能是通過增強(qiáng)親水性提高與底物的結(jié)合緊密度,從而提高催化活力。2、將TcPanD的原始酶和突變體純化至電泳純度,兩者純化蛋白大小均為65kDa。純化后的突變體比酶活為7.05 U/mg,是原始酶比酶活的2.45倍。對突變體TcPanD-R38H/K305S酶學(xué)性質(zhì)的研究表明:輔酶磷酸吡哆醛的最佳添加量為0.04%(m/v),最適溫度為50°C,最適pH為7.0。在低濃度(1mM)的金屬離子環(huán)境下,Na~+、Ni~(2+)、Co~(2+)、K~+、Ca~(2+)對突變體TcPanD-R38H/K305S有激活作用,高濃度(5mM)的金屬離子作用下,激活作用減弱,僅剩下Ni~(2+)、Na~+對突變體TcPanD-R38H/K305S還有明顯的激活作用。測定了突變體TcPanD-R38H/K305S的動力學(xué)參數(shù),K_m值為1.23 mM,V_(max)值為7.05 U·mg~(-1),酶催化常數(shù)K_(cat)為7.64s~(-1),酶催化速率K_(cat)/K_m為6.21 s~(-1)·mM~(-1)。TcPanD的K_m值為1.35 mM,V_(max)值為2.88 U·mg~(-1),K_(cat)為3.12 s~(-1),K_(cat)/K_m為2.31 s~(-1)·mM~(-1)。突變體TcPanD-R38H/K305S表現(xiàn)出更好的底物親和力以及更高的催化活力。3、以表達(dá)突變體TcPanD-R38H/K305S基因的大腸桿菌細(xì)胞作為生物催化劑,以L-天冬氨酸為底物,探究了不同催化條件,包括溫度、pH、輔酶、金屬離子和動力學(xué)參數(shù)等對β-丙氨酸產(chǎn)量的影響。確定了全細(xì)胞催化最適溫度為37 ~oC,最適pH為7.0,輔酶磷酸吡哆醛添加量為10μL/mL,底物濃度為50 g/L。在最適催化條件下,β-丙氨酸的產(chǎn)量可達(dá)10.89 g/L。最后采用5 L發(fā)酵罐誘導(dǎo)培養(yǎng)突變體TcPanD-R38H/K305S,收集的菌體于反應(yīng)釜中進(jìn)行全細(xì)胞催化反應(yīng),反應(yīng)體系為1L,37 ~oC、pH 7.0以及攪拌速度600 rpm的反應(yīng)條件下,267 g的底物L(fēng)-天冬氨酸通過分批補(bǔ)料的方式加入。經(jīng)過轉(zhuǎn)化,最后得到β-丙氨酸的量為170.53 g,摩爾轉(zhuǎn)化率為95.45%。
【學(xué)位單位】：浙江工業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：Q55
【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
第一章 緒論
    1.1 β-丙氨酸的概述
        1.1.1 β-丙氨酸的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)
        1.1.2 β-丙氨酸的應(yīng)用
        1.1.3 β-丙氨酸的合成
    1.2 L-天冬氨酸-α-脫羧酶的概述
        1.2.1 L-天冬氨酸-α-脫羧酶的催化機(jī)理
        1.2.2 利用L-天冬氨酸-α-脫羧酶生產(chǎn)β-丙氨酸的研究
    1.3 酶分子改造技術(shù)研究概述
        1.3.1 理性設(shè)計(jì)
        1.3.2 非理性設(shè)計(jì)
        1.3.3 突變體文庫篩選方法
        1.3.4 半理性設(shè)計(jì)
    1.4 課題的研究目的意義與主要研究內(nèi)容
        1.4.1 課題研究目的意義
        1.4.2 課題研究內(nèi)容
第二章 L-天冬氨酸-α-脫羧酶的蛋白質(zhì)工程改造
    2.1 前言
    2.2 實(shí)驗(yàn)材料
        2.2.1 菌株和質(zhì)粒
        2.2.2 試劑和材料
        2.2.3 培養(yǎng)基及相關(guān)試劑的配制
        2.2.4 主要器材
    2.3 實(shí)驗(yàn)方法
        2.3.1 L-天冬氨酸-α-脫羧酶基因的獲得
        2.3.2 L-天冬氨酸-α-脫羧酶基因的引物設(shè)計(jì)及合成
        2.3.3 易錯PCR擴(kuò)增L-天冬氨酸-α-脫羧酶基因
        2.3.4 PCR產(chǎn)物純化回收
        2.3.5 載體的雙酶切及純化
        2.3.6 L-天冬氨酸-α-脫羧酶基因與載體連接
        2.3.7 E.coli BL21(DE3)感受態(tài)的準(zhǔn)備及轉(zhuǎn)化
        2.3.8 陽性重組質(zhì)粒的鑒定
        2.3.9 隨機(jī)突變文庫的篩選
        2.3.10 突變體L-天冬氨酸-α-脫羧酶的酶活測定方法
        2.3.11 突變體的定點(diǎn)飽和突變
        2.3.12 L-天冬氨酸-α-脫羧酶的同源建模及突變位點(diǎn)分析
    2.4 結(jié)果與討論
        2.4.1 TcPanD基因的隨機(jī)突變
        2.4.2 變體文庫的初篩
        2.4.3 突變文庫復(fù)篩
        2.4.4 定點(diǎn)飽和突變
        2.4.5 突變體的分子對接分析
    2.5 小結(jié)
第三章 L-天冬氨酸-α-脫羧酶突變體的酶學(xué)性質(zhì)研究
    3.1 前言
    3.2 實(shí)驗(yàn)材料
        3.2.1 菌株和質(zhì)粒
        3.2.2 試劑與材料
        3.2.3 培養(yǎng)基與緩沖液
        3.2.4 儀器與設(shè)備
    3.3 實(shí)驗(yàn)方法
        3.3.1 突變體的表達(dá)與純化
        3.3.2 蛋白含量測定
        3.3.3 SDS-PAGE電泳
        3.3.4 突變體的酶活測定
        3.3.5 輔酶磷酸吡哆醛(PLP)的添加量對酶的影響
        3.3.6 酶的最適溫度及溫度穩(wěn)定性測定
        3.3.7 酶的最適pH及 pH穩(wěn)定性測定
        3.3.8 不同濃度金屬離子對酶活的影響
        3.3.9 酶的反應(yīng)動力學(xué)參數(shù)測定
    3.4 結(jié)果與討論
        3.4.1 蛋白質(zhì)濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線
        3.4.2 SDS-PAGE分析
        3.4.3 酶磷酸吡哆醛(PLP)的添加量對突變體的影響
        3.4.4 酶的最適溫度及溫度穩(wěn)定性
        3.4.5 酶的最適pH及 pH穩(wěn)定性
        3.4.6 不同濃度金屬離子對酶活力的影響
        3.4.7 突變體的動力學(xué)參數(shù)
    3.5 小結(jié)
第四章 L-天冬氨酸-α-脫羧酶重組菌的5 L發(fā)酵罐培養(yǎng)及全細(xì)胞轉(zhuǎn)化
    4.1 前言
    4.2 實(shí)驗(yàn)材料
        4.2.1 菌株
        4.2.2 培養(yǎng)基與緩沖溶液
        4.2.3 主要儀器
    4.3 實(shí)驗(yàn)方法
        4.3.1 全細(xì)胞生物催化劑的制備
        4.3.2 轉(zhuǎn)化時間對β-丙氨酸產(chǎn)量的影響
        4.3.3 轉(zhuǎn)化溫度對β-丙氨酸產(chǎn)量的影響
        4.3.4 緩沖液pH對 β-丙氨酸產(chǎn)量的影響
        4.3.5 輔酶PLP添加量對β-丙氨酸產(chǎn)量的影響
        4.3.6 底物濃度對β-丙氨酸產(chǎn)量的影響
        4.3.7 全細(xì)胞轉(zhuǎn)化制備β-丙氨酸
    4.4 結(jié)果與討論
        4.4.1 轉(zhuǎn)化時間對產(chǎn)β-丙氨酸的影響
        4.4.2 轉(zhuǎn)化溫度對產(chǎn)β-丙氨酸的影響
        4.4.3 緩沖液pH對產(chǎn)β-丙氨酸的影響
        4.4.4 輔酶PLP添加量對產(chǎn)β-丙氨酸的影響
        4.4.5 底物濃度對產(chǎn)β-丙氨酸的影響
        4.4.6 全細(xì)胞轉(zhuǎn)化制備β-丙氨酸
    4.5 小結(jié)
第五章 總結(jié)和展望
    5.1 總結(jié)
    5.2 展望
參考文獻(xiàn)
致謝
作者簡介
    1 作者簡歷
    2 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文
學(xué)位論文數(shù)據(jù)集

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