熒光探針憑借其技術(shù)簡單,結(jié)構(gòu)靈活,靈敏度好,無創(chuàng)檢測等特點,已成為生物檢測的重要工具。然后,細胞環(huán)境較為復(fù)雜,熒光探針在檢測時面臨諸多問題。理想的熒光探針應(yīng)具有高滲透性,無背景干擾,較低的光漂白和光毒性,以助于生物體系內(nèi)的實時檢測和長時間觀察而不損害細胞。為了解決這些困擾,雙光子熒光探針孕育而生。另外,雙光子顯微成像技術(shù)與雙光子探針的完美結(jié)合,促進了探針的進步。雙光子顯微成像技術(shù)是將近紅外光子作為激發(fā)光源,長波低能量的激發(fā)光,提高了探針在檢測時的穩(wěn)定性和時空分辨率,降低了光漂白和光毒性,有助于探針在細胞,組織和活體中的應(yīng)用。近年來,雙光子熒光探針已成為生命醫(yī)學(xué)中極其重要的研究工具。亞細胞器線粒體不僅僅為細胞提供源源不斷的能量,而且還與細胞分化,增殖,凋亡和信息的傳遞等有關(guān)。細胞內(nèi)黏度與信號的傳導(dǎo),生物分子的相互作用和代謝物的擴散息息相關(guān),在亞細胞水平亦是如此。線粒體基質(zhì)黏度的異常變化誘使線粒體網(wǎng)組織的改變,進而影響代謝的擴散,這與許多的疾病和功能障礙有關(guān)(糖尿病,阿爾茨海默病,動脈粥樣硬化)。細胞內(nèi)SO2主要通過含硫氨基酸的氧化或亞磺酰丙酮的氧化分解產(chǎn)生,細胞內(nèi)除了以SO2氣態(tài)分子的形式純在外,還以HSO3-/SO32-及其鹽的形式存在。SO2可作為氣態(tài)信號分子介導(dǎo)生理過程,也可以作為抗氧化劑和抗還原劑調(diào)節(jié)氧化還原平衡。線粒體SO2被認為可顯著減輕心肌損傷和異丙腎上腺素誘導(dǎo)的線粒體的腫脹和變形。溶酶體是大多數(shù)動/植物細胞中常見的亞細胞器,它包含多種水解酶。溶酶體極性是生物微環(huán)境中重要的參數(shù),不僅影響自身的形狀,結(jié)構(gòu)和膜透性,而且決定了水解酶的相互作用。溶酶體極性與大分子的分解,水解酶的活性,消化細胞碎片,自噬,清除受損結(jié)構(gòu)有關(guān)。另外,溶酶體各區(qū)域極性差異明顯。在細胞凋亡過程中,溶酶體極性可作為反應(yīng)因子來觀察細胞微環(huán)境變化,這對研究細胞生物學(xué)和腫瘤病理學(xué)具有重要的意義。通過大量的文獻閱讀和本課題組的工作積累,本文設(shè)計合成了兩種咔唑為母體的亞細胞器定位的微環(huán)境雙光子熒光探針,并用精準的化學(xué)結(jié)構(gòu)表征手段對中間產(chǎn)物和目標化合物進行結(jié)構(gòu)驗證,測試了其光學(xué)性能和生物性能并取得了一系列有意義的成果。1.設(shè)計合成了雙檢測線粒體黏度和SO2衍生物的雙光子熒光探針MCB。向N-乙基-咔唑母體引入強吸電子基3-甲基苯并噻唑碘摀鹽和弱給電子對甲氧基苯乙炔,整體形成一個強的ICT系統(tǒng)。當MCB為整體時,與N-乙基-咔唑母體雙鍵連接3-甲基苯并噻唑碘摀鹽可做為分子轉(zhuǎn)子檢測黏度,其紅色熒光發(fā)射峰在566 nm處。當SO2衍生物通過邁克爾加成反應(yīng)與MCB的α,β-不飽和乙烯基-3-甲基苯并噻唑摀部分反應(yīng)時,共軛體系被破壞,并且剩余的弱ICT系統(tǒng)導(dǎo)致短波發(fā)射,其藍色熒光發(fā)射峰在392 nm處。隨著SO2衍生物的滴加,溶液逐漸從黃色變成無色。MCB對SO2衍生物的檢測具有較低的檢測限(2 nM)和較快的反應(yīng)時間(～60 s),可以高效靈敏的檢測內(nèi)源SO2衍生物。此外,MCB檢測黏度和SO2衍生物的熒光發(fā)射不會互相干擾。MCB具有優(yōu)秀的雙光子性能,細胞毒性低,小鼠肝臟切片組織穿透深度達到120 um,細胞成像顯示專一定位線粒體。MCB可定量檢測溶液和細胞中的黏度,通過熒光壽命成像,定量分析細胞的黏度分布。MCB可以檢測溶液和細胞線粒體中內(nèi)/外源SO2衍生物,可視化檢測斑馬魚的黏度和HSO3-。2.設(shè)計合成了溶酶體定位的雙光子極性熒光探針PCT。通過向咔唑母體引入一個溶酶體靶向定位基團和一個極性響應(yīng)的基團來設(shè)計并合成雙光子熒光探針PCT。在PCT探針分子中,堿性四乙烯吡啶基為溶酶體定位組,氮乙基咔唑是雙光子熒光團,三苯胺烯酮基為極性響應(yīng)基團并形成一個良好的D-π-A結(jié)構(gòu),典型的ICT機理分子構(gòu)型,是極性分子設(shè)計的必要條件,各結(jié)構(gòu)單元相連構(gòu)成一個大的共軛體系。通過光學(xué)測試發(fā)現(xiàn)PCT對溶劑的極性變化有良好的熒光響應(yīng),可定量檢測溶液極性。PCT具有優(yōu)良的雙光子性能,不受溫度和pH的影響。在HeLa細胞細胞毒性和共定位試驗表明,PCT細胞毒性低和較好的溶酶體定位。另外,通過雙光子熒光共聚焦細胞成像,觀察細胞凋亡過程中溶酶體極性的變化。
【學(xué)位單位】：安徽大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：O657.3;Q244
【部分圖文】：

（Ｌｙｓｏ－ＭＣＯ和ＭＰＣＢ）。在探針ＭＣＢ的結(jié)構(gòu)中，作為強供體基團的Ｎ－乙基＿逡逑咔唑和雙光子熒光團與弱供體基團對甲氧基苯乙炔連接以形成弱分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)逡逑移（ＩＣＴ）系統(tǒng)（圖２－１），其中根據(jù)我們合成的探針Ｌｙｓｏ－ＭＣＯ的光物理特性，逡逑己知在短波長（約４００ｎｍ）處具有熒光發(fā)射峰［１５４］。由于Ｎ－乙基咔唑與３－甲基苯逡逑并噻唑

本文編號：2826814