蛋白酶3(proteinase 3,PR3)是一種中性絲氨酸蛋白酶,主要儲存于中性粒細(xì)胞的嗜天青顆粒和特定顆粒以及分泌囊泡中,或者轉(zhuǎn)移到質(zhì)膜上。PR3能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)蛋白,殺死微生物,還能影響血小板和內(nèi)皮細(xì)胞的活化,調(diào)節(jié)多種細(xì)胞因子、細(xì)胞表面受體的生物活性,參與炎癥部位的免疫調(diào)節(jié)反應(yīng),是一種參與多種生理活動的多功能蛋白。近年來,大量研究表明,PR3與多種疾病如血管炎性肉芽腫病(granulomatosis with polyangiitis,GPA)、慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary diseases,COPD)等的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)�？怪行粤＜�(xì)胞胞漿抗體(ANCA)是特異性自身抗體,與各種原發(fā)性小血管炎相關(guān),且ANCA的滴度與疾病活動一致。作為ANCA的主要靶抗原之一,PR3及其自身抗體(ANCA)在臨床診斷、指導(dǎo)治療以及疾病病理機制研究等方面具有重要的意義。天然人源PR3蛋白是臨床上用于相關(guān)疾病診斷的最佳選擇,但其來源較少,分離純化過程復(fù)雜,質(zhì)量不均,成本高昂。因此,嚴(yán)重阻礙了相關(guān)疾病體外診斷技術(shù)的應(yīng)用,通過重組技術(shù)生產(chǎn)人PR3蛋白是比較好的解決方案。目前,雖然已經(jīng)在大腸桿菌、酵母和昆蟲細(xì)胞Sf-9等多種細(xì)胞系中成功表達了人PR3,但仍存在許多問題,如操作復(fù)雜,產(chǎn)量低,重組蛋白抗原性差,成本較高等等,從而無法用來取代天然人源PR3蛋白。本研究嘗試?yán)眉倚Q桿狀病毒表達系統(tǒng)在家蠶幼蟲中表達重組人PR3。我們設(shè)計表達的人PR3蛋白,其C端含6個組氨酸的His-標(biāo)簽,在N端引入昆蟲分泌信號肽Mel;將利用PCR擴增得到的Mel-PR3-His片段連接到供體質(zhì)粒pFastBac1上,獲得重組供體質(zhì)粒pFastBac1-Mel-PR3-His;以重組供體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染大腸桿菌BmDH10Bac,經(jīng)Tn7轉(zhuǎn)座元件與家蠶BmNPV桿狀病毒穿梭載體Bacmid發(fā)生轉(zhuǎn)座,藍(lán)白斑篩選后提取出成功轉(zhuǎn)座的重組Bacmid DNA;將重組Bacmid DNA轉(zhuǎn)染家蠶BmN細(xì)胞,從而制備得到重組病毒;以重組病毒感染家蠶幼蟲,所表達的重組人PR3經(jīng)昆蟲分泌信號肽介導(dǎo)被釋放到血淋巴,收集感染后家蠶幼蟲的血淋巴;血淋巴上清通過鎳柱再結(jié)合兩種離子交換柱的綜合層析方法進行分離純化,最終獲得重組人PR3蛋白,通過單抗雜交和質(zhì)譜鑒定進行了驗證。本研究通過家蠶-桿狀病毒表達系統(tǒng)在五齡家蠶幼蟲中成功制備了重組人PR3蛋白,該方法不僅成本低,而且表達量高,便于大規(guī)模生產(chǎn),開辟了利用家蠶幼蟲作為生物反應(yīng)器高效生產(chǎn)具有免疫反應(yīng)活性重組人PR3蛋白的一條可行的新途徑,為相關(guān)疾病病理研究及診斷等方面提供了一種探索。
【學(xué)位單位】：江蘇大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：Q78;Q55
【部分圖文】：

2圖 1.1 PR3 的序列與三維結(jié)構(gòu)[11]Fig 1.1 Sequence and three-dimensional structure of PR3注：圖 A 為人 PR3 蛋白的序列（用糜蛋白酶原編號），催化三聯(lián)體（His57，Asp102，Ser195）的氨基酸的位置以紅色突出顯示，糖基化位點（Asn159, Asn113）以藍(lán)色突出顯示。圖 B 為 PR3 三維結(jié)構(gòu)，PR3 包含兩個不對稱的 β-桶和 C 末端 -螺旋。N 端和 C 端的柔性環(huán)分別以綠色和青色示出。催化三聯(lián)體 His57、Asp102 和 Ser195 以球-棒表示。圖 B 源自文獻[11]做了修改。Note: A, the sequence of human PR3 protein. The position of the amino acid of the catalytictriad [(His57, Asp102, Ser195 (using chymotrypsin numbering)] is highlighted in red, and theglycosylation site (Asn159, Asn113) is highlighted in blue. B, PR3 contains two asymmetricβ-barrels and a C-terminal -helix. The flexible loops of the N-terminal and C-terminal β-barrelsare depicted in green and in cyan, respectively. The catalytic triad (His57, Asp102, and Ser195)areshown in a ball-and-stick representation.PR3 與其他糜蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶如 HNE、CG 一樣都具有相似的結(jié)構(gòu)，

圖I，為坦)

圖 2.1 重組桿狀病毒構(gòu)建的流程示意圖Fig 2.1 The Schematic diagram of recombinant baculovirus construction.4.1 PCR 反應(yīng)計用于 PCR 擴增人 PR3 的引物如下：R3-F：5’-AGGAGACTCGAGATCGTGGGCGGGCACGAGGCG-3’R3-R：5’-TACGGTACCCTAGTGATGGTGATGGTGATGACGGCGCAGCGACG-3’在引物 N 端和 C 端分別引入 Xho I 和 Kpn I 酶切位點（均以雙下劃線標(biāo)注時，其C端還引入了編碼6個組氨酸的堿基（以單下劃線標(biāo)注）。以PR3的c模板進行 PCR 反應(yīng)。反應(yīng)體系如下所示：表 2.10 PCR 反應(yīng)體系

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 張忠信;;ICTV第九次報告對病毒分類系統(tǒng)的一些修改[J];病毒學(xué)報;2012年05期

2 韓慶功;崔艷紅;劉保國;;昆蟲桿狀病毒表達系統(tǒng)在禽流感病毒研究中的應(yīng)用[J];吉林農(nóng)業(yè)科學(xué);2010年01期

本文編號：2823970