近幾十年來,抗生素(Antibiotics)污染成為了一個(gè)亟待解決問題。水環(huán)境中,長(zhǎng)期的抗生素壓力可能破壞魚類腸道菌群的結(jié)構(gòu)平衡。水生動(dòng)物的腸道在抗生素耐藥基因(Antibiotic resistant genes,ARGs)的傳播中占據(jù)著重要的生態(tài)位,并能直接反映其生境變化。四環(huán)素(Tetracycline)是自然環(huán)境中檢測(cè)頻率第二高的抗生素。然而,目前關(guān)于環(huán)境濃度四環(huán)素對(duì)魚類腸道細(xì)菌耐受性以及腸道菌群結(jié)構(gòu)影響的綜合性研究仍然匱乏。為了探究實(shí)際環(huán)境濃度四環(huán)素對(duì)魚類腸道菌群耐藥性和腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響,本研究以金魚為試驗(yàn)對(duì)象,使用不同濃度四環(huán)素(0.285,2.85μg/L)處理金魚至21天,分別在第7天和第21天取樣,首先采用平板涂布法統(tǒng)計(jì)腸道可培養(yǎng)細(xì)菌耐藥率,用特異性引物gyrB檢測(cè),結(jié)合生理生化試驗(yàn)和16S rRNA基因序列篩選鑒定氣單胞菌屬(Aeromonas)耐藥菌,并使用微量肉湯稀釋法檢測(cè)分離株的最小抑菌濃度(MIC)值;其次使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)技術(shù)檢測(cè)腸道內(nèi)容物中的四環(huán)素耐藥基因(tetA、tetB、tetC、tetG、tetK、tetL、tetM、tetO、tetQ、tetW、tetZ和tetX),磺胺耐藥基因(sul1、sul2和sul3)和整合子(intI1和intI2)的豐度;最后通過高通量測(cè)序表征腸道菌群結(jié)構(gòu)的變化情況。主要研究結(jié)果如下:1.四環(huán)素處理金魚7天后,低濃度組(L7)的耐藥率未發(fā)生顯著變化(1.04%),但7天高濃度組(H7)以及處理21天后低濃度組(L21)和高濃度組(H21)組的抗性細(xì)菌比例均顯著增加,分別增至23.0%;38.43%,62.05%。這表明經(jīng)四環(huán)素處理金魚后可顯著提高腸道可培養(yǎng)細(xì)菌的耐藥比率。2.在本研究中,分別在C7,L7,H7,C21,L21和H21組中分離出21,15,47,26,36和19株氣單胞菌屬耐藥菌株。共鑒定出6種Aeromonas細(xì)菌,包括A.salmonida,A.hydrophila,A.caviae,A.media,V.schubertii和V.sobria。四環(huán)素處理金魚后,處理組中的A.schubertii和A.salmonicida逐漸成長(zhǎng)為優(yōu)勢(shì)種;并隨著四環(huán)素濃度的增加和處理時(shí)間的延長(zhǎng),優(yōu)勢(shì)種從A.salmonicida變?yōu)锳.Schubertii。3.對(duì)照組共分離的47株菌株中有38株的MIC值為32μg·mL~(-1),剩余9株耐藥菌的MIC為64μg·mL~(-1)。然而,L7和H7組的耐藥菌株MIC值增至128μg·mL~(-1),且H21組中1/4的耐藥菌株MIC值高達(dá)256μg·mL~(-1),表明持續(xù)的四環(huán)素壓力可以顯著提高細(xì)菌的耐受性。4.所有的耐藥基因(除了tetB),在金魚腸道中均有檢出。四環(huán)素處理21天后大部分基因的相對(duì)豐度顯著增加,其中,tetA、tetC、tetG和tetZ等的相對(duì)豐度最高(高于1.0×10~(-2)水平),表明四環(huán)素壓力是耐藥基因增加的主要因素。此外,四環(huán)素外排類耐藥基因的平均相對(duì)豐度(1.0×10~(-2))顯著高于編碼核糖體保護(hù)蛋白(平均水平1.0×10~(-3))和編碼四環(huán)素滅活酶(平均水平為1.0×10~(-5))的其他基因,表明四環(huán)素外排泵機(jī)制是微生物應(yīng)對(duì)環(huán)境四環(huán)素脅迫的主要機(jī)制。5.Fusobacteria,Firmicutes和Proteobacteria是金魚腸道細(xì)菌的3個(gè)優(yōu)勢(shì)門類,在四環(huán)素處理下其多樣性分別呈現(xiàn)增加,減少和動(dòng)態(tài)平衡的趨勢(shì),屬水平也呈現(xiàn)類似趨勢(shì),表明四環(huán)素壓力對(duì)金魚腸道微生物區(qū)系的組成有顯著影響。多級(jí)物種差異判別分析(LEfSe)結(jié)果表明,在處理組中Fusobacterium,Kaistia,cetobacterium,Meganema,Aminobacter和Bosea是金魚腸道的標(biāo)志菌屬。此外,ARGs與腸道Cetobacterium,Rosemonas,Rhizobiales和Bosea等屬之間具有較強(qiáng)的相關(guān)性,表明以上屬可能是ARGs的潛在宿主。本研究探究了環(huán)境濃度四環(huán)素對(duì)金魚腸道菌群耐藥性和腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響,該結(jié)果有助于深入了解三者之間的作用情況,且對(duì)控制抗生素耐藥性的戰(zhàn)略制定和人類健康風(fēng)險(xiǎn)的評(píng)估具有一定現(xiàn)實(shí)意義。
【學(xué)位單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：Q17;X503.225
【部分圖文】：

類（1948 年~1963 年）屬于天然四環(huán)素，主要包括：結(jié)構(gòu)式見圖 1-1。金霉素和土霉素都是在 20 世紀(jì) 4的第一個(gè)成員。這些分子分別是金黃色鏈霉菌霉菌（S. rimosus）的產(chǎn)物（Duggar 1948, 2011; Fin產(chǎn)生的其他天然四環(huán)素，例如由金黃色葡萄球菌（環(huán)素。第二代半合成四環(huán)素（1965 年~1972 年），新型化合物，半合成四環(huán)素的開發(fā)側(cè)重于改善四環(huán)主要包括：強(qiáng)力霉素、米諾環(huán)素、多西環(huán)素以及甲藥代動(dòng)力學(xué)（Agwuh andAlasdair, 2006）。第三代四基甲基環(huán)素。甘氨酰環(huán)素是 9-甘氨酰胺類似物，例素等，這種結(jié)構(gòu)修飾確保了與核糖體的更有效的相性機(jī)制，包括第一代和第二代四環(huán)素的外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋, 2004）。

定的氣單胞菌屬分離株的比例。C7 和 C21 分別代表 7 天和 21 天表 0.285 μg·L-1四環(huán)素處理 7 天組，2.85 μg·L-1四環(huán)素處理 7 天四環(huán)素處理 21 天組，2.85 μg·L-1四環(huán)素處理 21 天組。ions of identified Aeromonas isolations in different groups. C7 and Control groups, respectively, and L7, H7, L21, H21 represent samples samples in 2.85 μg·L-1group at 7days, samples in 0.285 μg·L-1grousamples in 2.85 μg·L-1group at 21 days, respectively.

圖 3-1 金魚腸道微生物 16S rRNAPCR 擴(kuò)增結(jié)果Fig. 3-1 16S rRNAamplification results of intestinal microflora in goldfish以看出（圖 3-1），PCR 產(chǎn)物目的條帶清晰單一，大小正確，且測(cè)，符合上機(jī)要求可以進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。道菌群多樣性分析中，共收集了 15 個(gè)樣本中的 691 221 個(gè)高質(zhì)量序列，將每個(gè)樣度（抽平后每個(gè)樣本 42,038 條序列）并進(jìn)行聚類后，在 3％差操作分類單位（OTU）。稀釋曲線（Rarefaction curves）是指在量的序列，統(tǒng)計(jì)其所代表的物種數(shù)目，再以序列數(shù)與物種數(shù)來構(gòu)樣品數(shù)據(jù)量是否合理。本研究樣品的 OUT 稀釋曲線如圖 3-2 所逐漸趨于平坦，且所有樣品的覆蓋度（coverage）都達(dá)到了99.9%（的測(cè)序深度合格，測(cè)序數(shù)據(jù)合理可用。

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