發(fā)布時(shí)間：2020-09-16 12:07

　　 環(huán)氧水解酶(epoxide hydrolases,EHs,EC 3.3.2.-)可對(duì)映選擇性催化外消旋環(huán)氧化物開(kāi)環(huán),形成相應(yīng)的光學(xué)純鄰二醇和保留未反應(yīng)的環(huán)氧化物,或區(qū)域選擇性開(kāi)環(huán),將底物完全轉(zhuǎn)化為手性鄰二醇。手性鄰二醇是一類藥物的手性砌塊,例如R型間氯苯基乙二醇(wCPED)可用于合成一種β3-腎上腺素受體激動(dòng)劑。本實(shí)驗(yàn)室前期從菜豆(Phaseolus vulgaris)基因組擴(kuò)增了一種新型EH的編碼基因(pvehl),并在E.coli BL21(DE3)中表達(dá)。研究表明,PvEH1對(duì)間氯環(huán)氧苯乙烷(mCSO)催化特性不理想。本研究以PvEH1為對(duì)象,擬借助分子對(duì)接、定點(diǎn)突變等技術(shù)分析其底物結(jié)合口袋對(duì)催化特性的影響。通過(guò)定向改造PvEH1改善其催化特性并進(jìn)行機(jī)制分析。最后,優(yōu)化反應(yīng)條件并規(guī)模制備(R)-mCPED。對(duì)PvEH1進(jìn)行同源模擬,構(gòu)建了其3D結(jié)構(gòu)模型。分別以(R)-與(S)-mCSO為模式底物,通過(guò)分子對(duì)接,確認(rèn)了 23個(gè)底物結(jié)合口袋上與mCSO發(fā)生相互作用的位點(diǎn)(除催化位點(diǎn))。再結(jié)合PvEH1與多個(gè)高對(duì)映歸一性EHs序列比對(duì)的結(jié)果和文獻(xiàn)報(bào)道確認(rèn)了16個(gè)位點(diǎn)的擬取代氨基酸,剩余7個(gè)位點(diǎn)分別以亮氨酸取代。分別構(gòu)建了 23個(gè)單點(diǎn)突變體,其中酶活性顯著提高的單點(diǎn)突變體包括PvEH1V1061、PvEH1M129L、PvEH1M160A、PvEH1M175I和PvEH1S178T等5個(gè),其中最優(yōu)為PvEH1M129L,酶活性是PvEH1的1.6倍;對(duì)映歸一性顯著提高的單點(diǎn)突變體包括PvEH1W102L、PvEH1L105I、PvEH1Y149L和PvEH1P84L等4個(gè),對(duì)映歸一性最高為PvEH1W102L(80.6%eep),是PvEH1 的 80.6倍。將9個(gè)提高PvEH1催化特性的位點(diǎn)分為兩類:5個(gè)位點(diǎn)提高酶活性(106、129、160、175和178)和4個(gè)位點(diǎn)提高對(duì)映歸一性(102、105、149和184),分別進(jìn)行單點(diǎn)飽和突變以篩選各位點(diǎn)上的最優(yōu)氨基酸。結(jié)果表明,5個(gè)提高酶活性的位點(diǎn)最優(yōu)氨基酸分別為I、L、A、I和T,并構(gòu)建5位點(diǎn)隨機(jī)組合突變文庫(kù)并篩選獲得了酶活性最優(yōu)突變體PvEH1Z4(包含V106I、M160A、M175I和S178T)酶活性為野生型的3.1倍。4個(gè)提高對(duì)映歸一性的位點(diǎn)最優(yōu)氨基酸分別為L(zhǎng)、I、L和W。以PvEH1Z4為模板,構(gòu)建4位點(diǎn)隨機(jī)組合突變文庫(kù)并篩選獲得了最優(yōu)突變體PvEH1Z4X4-59(包含V106I、M160A、M175I、S178T、L105I和P184W),與PvEH1相比,酶活性和對(duì)映歸一性分別提高了 2.6倍和92.6 倍。測(cè)定了 PvEH1和其突變體區(qū)域選擇性系數(shù)和對(duì)映體比率(enantiomeric ratio,E),并結(jié)合分子動(dòng)力學(xué)模擬技術(shù)分析其提高機(jī)理。意外發(fā)現(xiàn),W102L可大幅提高突變體的對(duì)映選擇性,例如E.coli/pveh1W102L對(duì)mCSO的E值為30,不利于其對(duì)映歸一性水解rac-mCSO。另外,E.coli/pvehlW102L對(duì)與mCSO相似的底物對(duì)氯環(huán)氧苯乙烷(pCSO)E值為89。這意味著E.coli/pvehlW102L可應(yīng)用于動(dòng)力學(xué)拆分rac-pCSO。這可能是由于102位被亮氨酸取代抑制了PvEH1W102L活性中心與(R)-pCSO結(jié)合,卻未影響其結(jié)合(S)-pCSO,優(yōu)先催化(S)-pCSO水解,進(jìn)而提高了 PvEH1W102L對(duì)pCSO的對(duì)映選擇性。另一方面,184位被色氨酸取代、105位被纈氨酸取代后的PvEH1Z4X4-59區(qū)域選擇性系數(shù)αS和βr均大于96%。根據(jù)分子動(dòng)力學(xué)模擬結(jié)果,PvEH1Z4X-59上W184的側(cè)鏈基團(tuán)與(S)-mCSO上氯基發(fā)生相互作用,使后者的Cα優(yōu)先受到攻擊而生成(R)-mCPED,同時(shí)與(R)-mCSO結(jié)合方式保持不變,賦予了PvEH1Z4X4-59對(duì)rac-mCSO的對(duì)映歸一性。優(yōu)化了 E coli/pvehlW102L動(dòng)力學(xué)拆分rac-pCSO初始反應(yīng)濃度和反應(yīng)時(shí)間。E.coli/pvehlW102L催化150 mM rac-pCSO 4 h后,可同時(shí)獲得高純度的(R)-pCSO和(R)-pCPED,(R)-pCSO的產(chǎn)率為45.62%,ees為96.3%;(R)-pCPED 的產(chǎn)率為50.91%,eep為90.26%。另外,優(yōu)化了E.coli/pvehlZ4X4-59對(duì)映歸一性水解rac-mCSO 反應(yīng)介質(zhì)和rac-mCSO的濃度。在含5%吐溫20的磷酸緩沖液中,水解2.7 g rac-mCSO制備了2.51g(R)-mCPED,eep為93.1%,時(shí)空產(chǎn)率為6.32g·h-1.L-1。
【學(xué)位單位】：江南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：Q814
【部分圖文】：

江南大學(xué)碩士學(xué)位論文即在催化單一構(gòu)型的 SO 時(shí)，StEH1 存在區(qū)域選擇性，子時(shí)，會(huì)優(yōu)先攻擊某一個(gè)碳原子：如果進(jìn)攻有苯基取代的將會(huì)翻轉(zhuǎn)；如果進(jìn)攻沒(méi)有苯基取代的碳原子 (Cβ)，則其外文獻(xiàn)報(bào)道發(fā)現(xiàn)，這種現(xiàn)象在由 EHs 催化的反應(yīng)中具EHs 對(duì)不同構(gòu)型底物所呈現(xiàn)的區(qū)域選擇性互補(bǔ)可以將外鄰二醇產(chǎn)物，即利用 EHs 對(duì)不同構(gòu)型底物高度互補(bǔ)的化物。

圖 1-2 定向進(jìn)化流程圖Fig. 1-2 General strategy for directed evolution點(diǎn)的選擇性位點(diǎn)周圍或者底物結(jié)合口袋附近選擇對(duì)酶與底物結(jié)合有較理想的策略[47]。例如，Kotik等人，選擇來(lái)自于AspergillunEH底物口袋周圍的五定點(diǎn)飽和突變構(gòu)建了包含有9個(gè)位點(diǎn)到了一株對(duì)映歸一性提高19倍的突變酶[48]；Li等人，在VrEEH) 底物口袋周圍選取了4個(gè)氨基酸位點(diǎn)進(jìn)行突變，構(gòu)建了一株對(duì)映歸一性幾乎完美的突變酶[17]；Sun等人，選取erythropolis基因的EH) 底物口袋周圍10個(gè)氨基酸位點(diǎn)，采用 (Triple-CodeSaturationMutagenesis，TCSM) 構(gòu)建了突變文的突變酶[49]。另外，借助于計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)選取突變位點(diǎn)也包括虛擬突變文庫(kù)篩選、突變掃描、多序列比對(duì)等手段的引位點(diǎn)的效率。

圖 1-3 EHs 催化雙相體系中環(huán)氧化物的水解Fig. 1-3 EHs catalyzed the hydrolysis of epoxide in a biphasic system型表面活性劑溶劑相同，非離子型表面活性劑如曲拉通 100、吐溫 20 和吐溫酶活性和對(duì)映歸一性。在加入 2% (v/v) 吐溫 20 的反應(yīng)體 crescentus 和 Mugil cephalus 的兩種 EH 分別對(duì) SO 進(jìn)行對(duì)映歸-1,2-乙二醇 (phenyl-1,2-ethanediol，PED)，對(duì)映體純度為 89％Hs 催化外消旋環(huán)氧化物的對(duì)映歸一性的機(jī)制仍不明確，似乎，在脂肪酶的相關(guān)研究中，催化機(jī)理已經(jīng)有了比較深入的研究[6型表面活性劑 (不帶電且具有親水性頭) 是溫和的，與蛋白質(zhì)于增強(qiáng)脂肪酶活性，不像離子型表面活性劑，如十二烷基磺酸表面并降低脂肪酶活性[63]。的研究意義和研究思路

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本文編號(hào)：2819835