束縛-浸水應(yīng)激(restraint water-immersion stress,RWIS)是一種生理和心理上的復(fù)合型應(yīng)激,可在短時間內(nèi)誘發(fā)胃腸機能紊亂(如胃運動亢進、胃酸分泌增多、胃粘液分泌減少、胃粘膜損傷和腸運動加強等)。內(nèi)側(cè)前額葉(medial prefrontal cortex,mPFC)是哺乳動物最高級別的聯(lián)合皮層,具有思考記憶、整合信息以及指揮調(diào)控的功能。研究發(fā)現(xiàn),應(yīng)激1h大鼠mPFC內(nèi)Fos蛋白陽性表達明顯增多,表明mPFC核團參與RWIS了過程。那么,在RWIS過程中mPFC內(nèi)有哪些蛋白發(fā)生了變化?這些差異蛋白參與RWIS調(diào)控的可能信號通路及分子機制是什么?這些問題仍沒有得到解決。此外,突觸可塑性對于神經(jīng)元和神經(jīng)環(huán)路的穩(wěn)定具有重要作用。在RWIS過程中,mPFC的突觸可塑性是否發(fā)生改變以及發(fā)生怎樣的改變?nèi)砸娢从性敿?xì)報道。鑒于此,我們提出以下三個問題:1.RWIS導(dǎo)致大鼠mPFC內(nèi)哪些蛋白的表達量發(fā)生改變?這些差異蛋白參與調(diào)控的可能機制及信號通路如何?2.RWIS大鼠mPFC內(nèi)神經(jīng)元突觸的超微結(jié)構(gòu)是否發(fā)生改變?3.RWIS大鼠mPFC內(nèi)突觸相關(guān)的標(biāo)志性功能蛋白是否發(fā)生改變?為探索上述三個問題,設(shè)計以下三部分實驗:實驗一:將實驗動物隨機分為對照組(RWIS 0h)和實驗組(RWIS 4h),用同位素相對標(biāo)記與絕對定量技術(shù)(isobaric tags for relative and absolute quantification,iTRAQ)技術(shù)分析兩組間大鼠mPFC內(nèi)差異表達蛋白,進而對差異蛋白進行GO分析、KEGG分析和IPA分析,探索這些差異蛋白在應(yīng)激過程可能參與的信號通路以及分子機制。實驗二:將實驗動物隨機分為4組,即RWIS 0h(對照組)、RWIS 1h、RWIS 2h和RWIS 4h組。用高爾基染色法檢測RWIS不同時間段mPFC內(nèi)神經(jīng)元樹突棘密度的變化,用透射電鏡超薄切片技術(shù)觀察RWIS不同時間段mPFC內(nèi)PSD厚度、突觸間隙的寬度、突觸曲率以及突觸數(shù)密度等突觸超微結(jié)構(gòu)的變化,探究RWIS不同時間段大鼠mPFC內(nèi)突觸結(jié)構(gòu)可塑性是否發(fā)生改變以及發(fā)生了怎樣的改變。實驗三:分組情況同實驗二。分別采用免疫組織化學(xué)技術(shù)、蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù)、RTPCR技術(shù)檢測應(yīng)激不同時間段突觸標(biāo)志物——突觸后致密物蛋白PSD-95與突觸膨體素SYN蛋白及其mRNA相對表達量的變化,進而分析RWIS不同時間段大鼠mPFC的突觸功能可塑性是否發(fā)生改變以及發(fā)生了怎樣的改變。實驗結(jié)果表明:1.iTRAQ技術(shù)共鑒定出對照組與RWIS 4h兩組差異蛋白129種,其中有88種上調(diào)、41種下調(diào)。GO分析表明22%(29個)的差異蛋白與神經(jīng)系統(tǒng)功能直接相關(guān),包括突觸可塑性(6個)、軸突形態(tài)和生長(12個)、神經(jīng)發(fā)育與凋亡(10個)和神經(jīng)信號傳遞(1個)等。KEGG分析發(fā)現(xiàn)129種差異蛋白共富集到64條代謝通路,涉及突觸囊泡循環(huán)、毒理代謝等過程。IPA分析差異蛋白參與137條信號通路,其中只有Rho-GDI信號通路被抑制,整合素信號通路被激活。2.束縛-浸水應(yīng)激改變了大鼠mPFC的突觸結(jié)構(gòu)可塑性。樹突棘染色實驗發(fā)現(xiàn)各應(yīng)激組與對照組相比單位長度(10um)內(nèi)樹突棘的數(shù)量均有顯著性減少(P0.05)。隨著RWIS時間的延長,樹突棘的密度整體呈先下降再恢復(fù)的趨勢。其中RWIS 1h組樹突棘密度最低(P0.01),RWIS 2h與RWIS 4h組較RWIS 1h組樹突棘的密度有所升高,但無顯著性差異(P0.05)。電鏡下可以觀察到清晰的細(xì)胞結(jié)構(gòu),如細(xì)胞核、線粒體、高爾基體以及突觸等。突觸后部位電子致密物質(zhì)明顯增厚,在突觸前終末端有或多或少的囊泡,呈圓形或橢圓形,聚集在突觸前膜處,同時還可以觀察到部分與突觸前膜融合的囊泡。突觸活性區(qū)的長度以及突觸后致密帶的厚度和長度也各有不同。對照組細(xì)胞成分輪廓清晰,而應(yīng)激組輪廓欠清晰,穿孔型突觸較多,可以觀察到空泡化的線粒體,這說明氧化應(yīng)激反應(yīng)對線粒體造成了一定損傷。與對照組相比,RWIS 4h組單位面積突觸的數(shù)量顯著減少(P0.05),RWIS 1h和RWIS 2h組與對照組相比突觸數(shù)目有所減少,但差異均不顯著(P0.05)。與對照組相比,RWIS 4h組平直型突觸和U型突觸所占比例顯著減少(P0.05),而倒U型突觸所占的比例顯著上升(P0.05),RWIS 2h和RWIS 1h組與對照組相比均差異不明顯(P0.05)。RWIS 4h組突觸前囊泡的數(shù)量較對照組明顯減少(P0.05),RWIS 1h和RWIS2h組較對照組則無顯著性差異(P0.05)。突觸間隙的寬度隨著應(yīng)激時間的延長呈現(xiàn)先減小后又回增的趨勢,其中RWIS 1h和RWIS 2h組較RWIS 0h組突觸間隙的寬度均顯著降低(P0.05),但RWIS 4h組與對照組相比則無顯著差異(P0.05)。應(yīng)激不同時間段,各組PSD的厚度較對照組均有顯著性降低(P0.05),隨應(yīng)激時間的延長,PSD的厚度呈現(xiàn)先降低后恢復(fù)的趨勢。其中,在RWIS 2h組PSD厚度最低(P0.01),RWIS 4h組PSD厚度與RWIS 1h和RWIS 2h組相比有升高的趨勢,但無顯著性差異(P0.05)。3.束縛-浸水應(yīng)激改變了大鼠mPFC的突觸功能可塑性。免疫組化結(jié)果顯示PSD-95蛋白主要在胞漿及膜表面表達,呈棕色或者棕黃色。隨著應(yīng)激時間的延長,PSD-95陽性胞體數(shù)量呈現(xiàn)先降低后又恢復(fù)的趨勢,且各應(yīng)激組PSD-95陽性胞體數(shù)量均較對照組均有顯著性減少(P0.05)。其中RWIS 1h組PSD-5陽性表達量數(shù)量最低(P0.01),RWIS 2h和RWIS 4h組與RWIS 1h組相比,PSD-95表達量有所上升,但與RWIS 1h組無顯著性差異(P0.05)。SYN在整個胞質(zhì)中均有表達,呈棕黃色。RWIS 4h組與對照組相比,SYN的表達量顯著下降(P0.05),而RWIS 1h和RWIS 2h組與對照組相比略有上升,但無顯著性差異(P0.05)。免疫印跡結(jié)果與免疫組化結(jié)果一致,PSD-95表達整體呈先降低再升高的趨勢。應(yīng)激組與對照組相比,PSD-95相對表達量均有所降低,并具有顯著性差異(P0.05)。其中,RWIS 1h組PSD-95條帶相對表達量最低(P0.01),RWIS 2h和RWIS 4h組較RWIS1h組PSD-95的表達量增多,但無顯著性差異。SYN的表達整體呈現(xiàn)先升高再降低的趨勢。RWIS 4h組SYN的相對表達量最低,與應(yīng)激組相比有顯著性差異(P0.05),RWIS 1h組與RWIS 4h組較對照組SYN的表達略有上升,但無顯著性差異。PCR實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)SYN蛋白mRNA相對表達量與免疫組化和免疫印跡結(jié)果一致,RWIS 4h組與RWIS 0h組相比,mRNA表達顯著下調(diào)(P0.05),RWIS 1h和RWIS 2h組與對照組相比有減少趨勢,但無顯著性差異(P0.05)。與對照組相比,RWIS 1h和RWIS 2h組PSD-95蛋白mRNA表達量顯著上調(diào)(P0.05),RWIS 4h組mRNA卻表達無顯著差異(P0.05)。RWIS 4h組與RWIS 2h組相比,PSD-95蛋白mRNA表達下降(P0.05),但與RWIS 1h組相比無顯著性差異(P0.05)。綜合以上實驗,RWIS不同時間段對大鼠mPFC內(nèi)神經(jīng)元形成一定程度損傷,mPFC內(nèi)突觸可塑性下調(diào)。差異蛋白參與了氧化應(yīng)激、毒理代謝、轉(zhuǎn)錄翻譯以及細(xì)胞凋亡等生物過程,尤其是NDRG1和NYAP2蛋白在應(yīng)激中可能參與了機體的保護機制。隨RWIS時間的延長,機體啟動應(yīng)激損傷調(diào)控機制,mPFC內(nèi)Rho-GDI信號通路的抑制和整合素信號通路的上調(diào)激活可能在神經(jīng)元的損傷修復(fù)以及突觸重塑過程中發(fā)揮重要功能。
【學(xué)位單位】：山東師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：Q42
【部分圖文】：

表 1- 2 大鼠 mPFC 中蛋白濃度與吸光值ug 進行以下處理：，60℃反應(yīng) 60 min。號 吸光值 濃度（0.7543 50.5659 40.7242 50.4863 3圖 1- 1 蛋白標(biāo)準(zhǔn)品濃度與紫外吸收值標(biāo)準(zhǔn)曲線

山東師范大學(xué)碩士學(xué)位論文以上變化，P<0.05 為差異蛋白選取標(biāo)準(zhǔn)，共鑒定出差異蛋白 129 組相比，有 88 種蛋白質(zhì)表達上調(diào)，41 種表達下調(diào)。其中 22%（系統(tǒng)功能直接相關(guān)，包括突觸可塑性（6 個）、軸突形態(tài)和生長（（10 個）和神經(jīng)信號傳遞（1 個）。果鑒定及表達差異分析

山東師范大學(xué)碩士學(xué)位論文4 實驗結(jié)果4.1 樹突棘染色Hito 試劑盒染色樹突棘實驗發(fā)現(xiàn)，實驗組與對照組相比單位長度內(nèi)（10um）樹突棘的密度呈現(xiàn)先下降再上升的趨勢。實驗組樹突棘的密度均有顯著性減少（P<0.05）。其中 RWIS1h 組，樹突棘密度最低（P<0.01）。RWIS 2h 與 RWIS 4h 組與 RWIS 1h 組相比，樹突棘的密度有上升的趨勢，但無顯著性差異（P>0.05）。

【相似文獻】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 朱旭紅;張萍淑;程贊贊;孟燕;張利平;元小冬;;突觸可塑性相關(guān)蛋白及其與臨床疾病的關(guān)系[J];華北理工大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版);2017年03期

2 范鳴s

本文編號：2817492