【摘要】：細(xì)胞分裂過程中,姐妹染色單體的正確分離依賴于染色體動粒與紡錘體微管的穩(wěn)定連接。動粒是由多種蛋白質(zhì)亞基組成的大分子機器,亞基間的分子組裝與調(diào)控直接影響其與微管的連接。著絲粒蛋白CENP-I是動粒組成型亞基,在其他動粒亞基的招募和組裝過程中發(fā)揮重要的腳手架(scaffold)作用。敲除CENP-I會導(dǎo)致染色體錯配和細(xì)胞周期遲滯等異常。CENP-I與CENP-H、CENP-K、CENP-M可形成較為穩(wěn)定的四元復(fù)合物,構(gòu)成內(nèi)層動粒的核心組分。CENP-I在動粒分子的招募和組裝中發(fā)揮重要作用,但其結(jié)構(gòu)與功能仍有許多未知。我們首次解析了嗜熱毛殼菌Chaetomium thermophilum中CENP-I同源蛋白的氨基端(ctCENP-I~(NT))晶體結(jié)構(gòu)。ctCENP-I~(NT)由11條α-螺旋組成(α1-α11),α1-α10反向平行堆疊,形成典型的HEAT結(jié)構(gòu)域。α11呈單獨未配對狀態(tài),并回折包裹HEAT結(jié)構(gòu)域。由于經(jīng)典的HEAT結(jié)構(gòu)域具有彈性變化的特點,我們通過分子動力學(xué)模擬的方法研究外力對ctCENP-I~(NT)微觀結(jié)構(gòu)變化的影響。結(jié)果表明,力誘導(dǎo)HEAT結(jié)構(gòu)域構(gòu)型變化促進α11從HEAT結(jié)構(gòu)域上解離,提示α11可能參與維持HEAT結(jié)構(gòu)域的折疊狀態(tài)。晶體結(jié)構(gòu)顯示,α11螺旋與HEAT結(jié)構(gòu)域之間存在廣泛的疏水相互作用,α11螺旋的氨基酸殘基Phe208、Thr215和Leu219分別與HEAT結(jié)構(gòu)域的不同部位發(fā)生疏水相互作用。α11缺失后,HEAT結(jié)構(gòu)域(ctCENP-I~(HEAT))在尺寸排阻層析中呈現(xiàn)高度聚合狀態(tài),說明α11與HEAT結(jié)構(gòu)域之間的疏水相互作用能夠維持HEAT結(jié)構(gòu)域的穩(wěn)定構(gòu)象�；谝患壭蛄械纳镄畔W(xué)分析顯示,參與相互作用的Phe208、Thr215和Leu219在CENP-I同源蛋白中高度保守。這些位點的氨基酸突變會導(dǎo)致蛋白質(zhì)的構(gòu)象發(fā)生變化。此外,我們探究了ctCENP-I~(NT)與其他動粒亞基CENP-H/K的分子組裝機制。體外pull-down結(jié)果顯示,ctCENP-I~(NT)直接結(jié)合CENP-H/K,但α11缺失或關(guān)鍵位點氨基酸的突變會影響HEAT結(jié)構(gòu)域的折疊狀態(tài),失去或降低CENP-H/K的結(jié)合能力。免疫熒光成像實驗發(fā)現(xiàn),α11上的關(guān)鍵保守氨基酸殘基對CENP-I在著絲粒上的定位起著重要作用。本文研究結(jié)果首次揭示了ctCENP-I具有HEAT結(jié)構(gòu)域,并發(fā)現(xiàn)了影響HEAT結(jié)構(gòu)域構(gòu)象變化的關(guān)鍵區(qū)域。這些工作有助于我們對CENP-I發(fā)揮腳手架蛋白作用以及動粒組裝調(diào)控機制的理解。
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：Q253
【圖文】：

圖 1.1 著絲粒結(jié)構(gòu)圖（A）著絲粒結(jié)構(gòu)示意圖。著絲粒是染色體上連接姐妹染色單體的特定區(qū)域，著絲粒招募動粒，動粒與微管連接；（B）真核生物著絲�？煞譃閱沃z粒和全著絲粒；（C）單著絲粒分為點著絲粒和區(qū)域著絲粒。點著絲粒含有特定 DNA 序列，參與組裝單個 CENP-A 核小體。區(qū)域著絲粒通常包含大量重復(fù)的 DNA 序列，并參與組裝多個 CENP-A 核小體；（D）彌散型著絲粒，可以在染色體各個位置啟動動粒的裝配。Figure 1.1 The eukaryotic centromere type(A) Schematic diagram of centromere structure. Centromere is a specific region on the chromosomethat links sister chromatids. Centromeres recruits kinetochore, and kinetochore is connected tomicrotubules. (B) Eukaryotic centromeres can be divided into monocentrics and holocentrics; (C)Monocentrics are divided into point centromere and regional centromere. The point centromerecontains a specific DNA sequence involved in the assembly of a single CENP-A nucleosome. Regionalcentromeres usually contain a large number of repetitive DNA sequences and are involved in theassembly of multiple CENP-A nucleosomes; (D) Holocentromeres, which can initiate assembly ofkinetochore at various locations on the chromosome.

華 中 科 技 大 學(xué) 博 士 學(xué) 位 論 文著絲粒才能募集動粒，因此 CENP-A 也被認(rèn)為是著絲粒的表觀遺傳學(xué)標(biāo)志[17 20]。CENP-A 在不同物種中具有同源蛋白，如釀酒酵母中的 CSE4，裂殖酵母中的 CNP1，果蠅中的 CID，秀麗線蟲中的 HCP-3 等[21-23]。CENP-A 核小體結(jié)構(gòu)與經(jīng)典的 H3 核小體結(jié)構(gòu)相似[24,25]，組蛋白 H2A、H2B、H4 和 CENP-A 組成組蛋白八聚體，DNA 以左手方向纏繞在組蛋白八聚體周圍（圖 1.2 A）。CENP-A 核小體的組裝依賴 HJURP（Holliday junction recognition protein）。HJURP 的 CBD（CENP-A bind domain）與CENP-A 的 CATD 結(jié)構(gòu)域（centromere-targeting domain）特異性結(jié)合（圖 1.2 B），促進 CENP-A 與著絲粒 DNA 的相互作用[26,27]。AB

圖 1.3 脊椎動物有絲分裂動粒結(jié)構(gòu)模型粒包括 CCAN 和 KMN。著絲粒中 CENP-A 是募集 CCAN 的標(biāo)記。CCAN 是由 CENP-CENP-T/W/S/X、CENP-H/I/K/M、CENP-N/L 和 CENP-O/P/Q/R/U 16 種蛋白質(zhì)組成的復(fù)合物CAN 負(fù)責(zé) KMN 的招募。KMN 主要由 Knl1，Mis12 和 Ndc80 三種蛋白質(zhì)復(fù)合物組成，KM責(zé)連接紡錘體微管[3]。Figure 1.3 The model of the vertebrate mitotic kinetic structure[3]inetochore consists of CCAN and KMN. CENP-A in the centromere region is a marker for ecruitment of CCAN. CCAN composed of 16 subunits such as CENP-C, CENP-T/W/SENP-H/I/K/M, CENP-N/L and CENP-O/P/Q/R/U. CCAN is responsible for the recruitment of KMMN complex is mainly composed of three protein, Knl1, Mis12 and Ndc80, and it is responsible onnecting spindle microtubules[3]..2.1 內(nèi)層動粒蛋白 CCAN16 種 CCAN 亞基按相互作用和功能又進一步分為五個亞組：CENP-CENP-T/W/S/X[43]，CENP-H/I/K/M[44,45]，CENP-L/N[46,47]和 CENP-O/P/U/Q/R[48]。

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6 司震;錢

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