【摘要】：角蛋白(Keratin)是一類廣泛存在于自然界的非營養(yǎng)型硬蛋白,主要分布在動物的皮毛、蹄甲部位,結(jié)構(gòu)中含有大量氫鍵、半胱氨酸構(gòu)成的二硫鍵,二硫鍵相互作用形成致密的角蛋白結(jié)構(gòu)使其難以被降解利用。角蛋白酶(Keratianse)是一種可以特異性降解角蛋白的酶類,它能破壞羽毛角蛋白致密的結(jié)構(gòu)達(dá)到降解的目的。為了更好的利用角蛋白和開發(fā)角蛋白酶基因本研究從戈壁異常球菌(Deinococcus gobiensis)I-0和耐輻射異常球菌(Deinococcus radiodurans)R1中鑒定了三個角蛋白酶基因,分別命名為Kerdg1(DGO_RS02895)、Kerdg2(DGO_RS03965)、Kerdr(A2G07_RS01950),并在大腸桿菌中進行了異源表達(dá)和羽毛降解特性研究。主要結(jié)果如下:1、為了研究這三個基因,分析其序列結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)Kerdg1由1239堿基組成可編碼412個氨基酸殘基,分子量為:41.1 kDa;Kerdg2由1599堿基組成編碼532個氨基酸殘基,分子量為:53.78 kDa;Kerdr由1599堿基組成編碼532個氨基酸殘基,分子量為:53.39kDa。序列比對發(fā)現(xiàn)KerDG1、KerDG2、KerDR蛋白含有跨膜結(jié)構(gòu)和前導(dǎo)肽。結(jié)構(gòu)中信號肽(The signal peptide)、N端前肽(N-terminal pro-peptide)、成熟蛋白區(qū)(mature protease)、C端尾巴(C-terminal pro-peptide)這四個部分與peptidases_s8_s53家族蛋白相似,此外成熟蛋白區(qū)都有3個主要的氨基酸殘基(Asp、His、Ser)與已知的芽孢桿菌角蛋白酶(KerA)一致,確認(rèn)三個基因是角蛋白基因。2、將這3個角蛋白基因分別連接到pET22b載體中,并轉(zhuǎn)化到表達(dá)宿主BL21進行原核表達(dá)。對重組菌株進行降解能力分析,結(jié)果顯示重組菌株對羽毛的降解作用明顯。對重組菌株作用于羽毛后的產(chǎn)物進行檢測,結(jié)果顯示降解產(chǎn)物主要產(chǎn)生精氨酸、酪氨酸、脯氨酸、胱氨酸等21種氨基酸。3、將重組菌株誘導(dǎo)表達(dá),SDS-PAGE電泳分析結(jié)果顯示在菌液中、菌體上清中均能獲得目的蛋白。對角蛋白酶酶學(xué)性質(zhì)進行研究發(fā)現(xiàn)KerDG1最適pH和溫度是5.0和60℃,酶活3.5 U/mL。KerDG2的最適pH和溫度是8.0和40℃,酶活是3.0 U/mL。KerDR的最適pH和溫度是7.0和40℃,酶活是3.0 U/mL。耐受性實驗表明角蛋白酶能耐受一定的溫度和pH。同時,還發(fā)現(xiàn)酶對金屬離子和化學(xué)試劑也有一定的耐受性。
【學(xué)位授予單位】：西南科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：X705;X172
【圖文】：

2 kerdg1、kerdg2、kerdr 角蛋白酶的生物信息分析結(jié)構(gòu)主要分四個部分（圖 2-2 已用黑箭頭標(biāo)出）：信號肽 The signal peptide (pre)，N 端前肽 N-terminal pro-peptide ，成熟 蛋白區(qū) mature protease，C 端尾巴 C-terminalpro-peptide (C-pro)[76]5。成熟蛋白區(qū)（圖 2-2 紅色括號內(nèi)）有 3 個活性位點氨基酸殘基分別是 171 位的天冬氨酸殘基、203 位的組氨酸殘基、358 位的絲氨酸殘基。氨基酸序列預(yù)測圖表明該蛋白前端有一段序列形成前導(dǎo)肽，跨膜結(jié)構(gòu)分析結(jié)果還顯示該蛋白存在跨膜結(jié)構(gòu)。

建及鑒定菌屬角蛋白酶功能，本研究對耐輻射異常球耐輻射異常球菌含有 1 個角蛋白酶基因（k因（kerdg1、kerdg2）。根據(jù)基因序列設(shè)計特0 基因組中克隆出角蛋白酶基因，電泳結(jié)果 kerdr 條帶單一，與理論分子量一致�；厥彰盖衚erdg1、kerdr 的 PCR 產(chǎn)物和 pET 22b 表rdg2 的 PCR 產(chǎn)物和 pET-22b 表達(dá)載體并進行過夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌 BL21 (DE3)的 LB 平板培養(yǎng)后進行篩選。挑取單菌落進 2~5 中均有目的基因。提取重組菌株的質(zhì)粒進因均已成功插入載體。驗證正確后送北京擎核表達(dá)載體 pET22b-kerdg1、pET22b-kerdg2菌株加入 70 %甘油（終濃度為 10-20%）于圖如圖 3-4。

圖 3-2 菌落 PCR 驗證結(jié)果Fig.3-2 Results of PCR validation colonies：Trans2K PlansⅡmarker；1~6：分別是 pET22b-kerdg1 單菌落 1~6；7：陰性。b：M：Trans2K PlansⅡmarker；1~5：分別是 pET22b-kerA 單菌落 1~5；6：照；8：空白。c：M：Trans2K PlansⅡmarker；1~6：分別是 pET22b-kerdg2 單照；8：陽性對照 d：M：Trans2K PlansⅡmarker；1：陽性對照；2~6：分別是 pE5；7：空白；8：陰性對照。:Trans2K PlansⅡmarker；1~6: pET22b-kerdg1 colony 1~6；7: negative control；: M:Trans2K PlansⅡmarker；1~5: pET22b-kerA colony 1~5；6: negative control；8: blank space. c: M:Trans2K PlansⅡmarker；1~6: pET22b-kerdg2 colony 1~6；: positive control. d: M:Trans2K PlansⅡmarker；2: positive control；2~6: pET22b-ank space；8: negative control.20001000

【相似文獻】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 侯玉煌;丁宏標(biāo);;角蛋白酶研究進展及其在飼料工業(yè)中的應(yīng)用[J];中國畜牧雜志;2018年01期

2 李靜;井婧;李紹鈺;;角蛋白酶在畜禽行業(yè)中的應(yīng)用[J];中國家禽;2008年10期

3 趙小東,盧濤,劉玉峰;角蛋白酶研究進展[J];中國美容醫(yī)學(xué);2005年05期

4 羊希;李霞;姜河;廖學(xué)品;石碧;;K.paraultunense角蛋白酶的分離純化及酶學(xué)性質(zhì)研究[J];皮革科學(xué)與工程;2019年03期

5 王秋影;廖美德;;角蛋白酶的應(yīng)用研究進展[J];飼料廣角;2013年10期

6 王岳峰,余榮臺,汪濤;羽毛角蛋白酶搖瓶發(fā)酵及其生化特性的研究[J];江西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報;2004年03期

7 耿秀秀;周正富;劉盈盈;平淑珍;王勁;;戈壁異常球菌角蛋白酶基因的克隆及功能研究[J];生物技術(shù)通報;2019年03期

8 葉亞建,涂國全,張寶,孫宇暉,黃國亮,楊良波;角蛋白酶的提取和理化性質(zhì)的初步研究[J];江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報;1997年04期

9 宋勇峰;楊艷鋒;葉永彬;劉彥;;角蛋白酶、糖化酶與淀粉酶的協(xié)同脫毛工藝研究(續(xù))[J];中國皮革;2019年04期

10 胡介卿，洪玲芳，吳海龍，唐祥寧，郭國梁，趙和璋，張斌;角蛋白分解菌的分離選育、角蛋白酶提取及其應(yīng)用的研究[J];江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報;1995年03期

相關(guān)會議論文 前8條

1 蘇暢;龔勁松;史勁松;;角蛋白酶基因的克隆表達(dá)與改造[A];第十一屆中國酶工程學(xué)術(shù)研討會論文摘要集[C];2017年

2 張毅;申志強;鐘玉宜;李加琪;;羽毛角蛋白分解菌的分離及其角蛋白酶酶活特性的研究[A];第十二次全國畜禽遺傳標(biāo)記研討會論文集[C];2010年

3 高潔;何軍;余冰;毛湘冰;鄭萍;虞潔;陳代文;;畢赤酵母角蛋白酶基因工程菌產(chǎn)酶培養(yǎng)基適宜碳源選擇及重組酶酶學(xué)性質(zhì)分析[A];第七屆中國飼料營養(yǎng)學(xué)術(shù)研討會論文集[C];2014年

4 鄭海林;崔琳靜;呂桂霞;沈永年;符美華;劉維達(dá);;不同部位皮膚癬菌分泌的角蛋白酶含量測定及藥物敏感性實驗[A];2016全國中西醫(yī)結(jié)合皮膚性病學(xué)術(shù)年會論文匯編[C];2016年

5 高潔;余冰;何軍;虞潔;毛湘冰;鄭萍;羅鈞秋;陳代文;;畢赤酵母角蛋白酶基因工程菌重組酶在生長豬上的應(yīng)用效果[A];第七屆中國飼料營養(yǎng)學(xué)術(shù)研討會論文集[C];2014年

6 梁建東;韓燕峰;梁宗琦;;產(chǎn)角蛋白酶耐熱金孢菌的初篩研究[A];第八屆海峽兩岸菌物學(xué)學(xué)術(shù)研討會論文集[C];2007年

7 王平;范雪榮;蔡成崗;王強;崔莉;;羊毛角蛋白酶、蛋白酶防氈縮加工[A];“五洋杯”2010年江蘇紡織學(xué)術(shù)論文集[C];2011年

8 王平;范雪榮;蔡成崗;王強;崔莉;;羊毛角蛋白酶、蛋白酶防氈縮加工[A];“源明杯”第九屆全國染整前處理學(xué)術(shù)研討會論文集[C];2012年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前9條

1 張榮先;Brevibacillus parabrevis角蛋白酶的表征、異源表達(dá)及其分子改造[D];江南大學(xué);2017年

2 蔡成崗;角蛋白酶生產(chǎn)菌株選育、發(fā)酵與分離純化研究[D];浙江大學(xué);2007年

3 呂龍賢;L-抗壞血酸芳香酸酯酶法合成及微生物角蛋白酶研究[D];浙江大學(xué);2008年

4 劉柏宏;Bacillus licheniformis角蛋白酶的高效表達(dá)、熱穩(wěn)定性及底物特異性改造[D];江南大學(xué);2015年

5 胡洪;角蛋白酶基因工程菌的構(gòu)建和表達(dá)及重組酶酶學(xué)性質(zhì)與功效研究[D];四川農(nóng)業(yè)大學(xué);2013年

6 王平;羊毛表面生物酶改性及機制研究[D];江南大學(xué);2010年

7 武蕾;云南騰沖熱泉嗜熱微生物的遺傳多樣性及嗜熱角蛋白酶和脂肪酶的研究[D];山東大學(xué);2009年

8 方真;Stenotrophomonas maltophilia角蛋白酶的分子改造[D];江南大學(xué);2017年

9 胡嬋;甲真菌病致病菌毒力因子的體外研究[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2013年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 耿秀秀;異常球菌角蛋白酶的異源表達(dá)和羽毛降解特性研究[D];西南科技大學(xué);2019年

2 蔣少龍;芽孢桿菌CDJYB來源角蛋白酶基因克隆、表達(dá)及酶學(xué)特性研究[D];湖北工業(yè)大學(xué);2019年

3 陶麗妍;角蛋白酶的高效表達(dá)及其在納米銀生物合成中的應(yīng)用[D];江南大學(xué);2018年

4 文冰潔;羽毛降解菌株的分離鑒定及產(chǎn)酶研究[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2018年

5 朱耀霞;芽孢桿菌角蛋白降解菌及其胞外角蛋白酶的性質(zhì)、應(yīng)用研究[D];山東大學(xué);2018年

6 馬怡茗;高效降解羽毛的微白黃鏈霉菌Fea-10的分離鑒定及其角蛋白酶基因的異源表達(dá)[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2017年

7 舒?zhèn)W(xué);角蛋白酶高產(chǎn)菌株的選育及其產(chǎn)酶研究[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2017年

8 何敏;羽毛降解菌的篩分、培養(yǎng)及所產(chǎn)角蛋白酶性質(zhì)的研究[D];武漢理工大學(xué);2015年

9 徐志龍;產(chǎn)角蛋白酶菌株的分離篩選和羽毛粉固態(tài)發(fā)酵的初步研究[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2017年

10 龔潤;Stenotrophomonas maltophilia DHHJ降解羽毛的生理生化機制研究[D];東華大學(xué);2012年

本文編號：2769412