【摘要】：褪黑素在生物體中普遍存在。在動物中,褪黑素作為一種重要的神經(jīng)激素調(diào)節(jié)晝夜節(jié)律。植物褪黑素最早于1995年被發(fā)現(xiàn)。二十余年來,國內(nèi)外研究者在褪黑素參與植物生長發(fā)育和脅迫應(yīng)答等方面開展了廣泛研究,并且取得了很大的進(jìn)展。然而,由于缺乏對其受體與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的認(rèn)識,植物褪黑素是否是一種新激素還存在很大爭議。本研究以蠶豆和擬南芥為植物材料,利用藥理學(xué)、生理學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)以及遺傳學(xué)等手段研究植物褪黑素的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,鑒定了植物中首個可能的褪黑素受體(CAND2/PMTR1),并揭示了褪黑素受體CAND2/PMTR1依賴的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在氣孔關(guān)閉和干旱脅迫中的調(diào)控機(jī)理。具體研究結(jié)果如下:1.使用不同濃度的褪黑素處理蠶豆葉片下表皮條考察褪黑素對氣孔開度的調(diào)控機(jī)理。研究結(jié)果表明,5-20μmol/L褪黑素顯著誘導(dǎo)蠶豆氣孔關(guān)閉和保衛(wèi)細(xì)胞H_2O_2產(chǎn)生。在10μmol/L褪黑素處理下,外源添加過氧化氫酶(CAT,H_2O_2清除劑)或二苯基氯化碘鹽(DPI,NADPH氧化酶抑制劑)抑制了褪黑素誘導(dǎo)的氣孔關(guān)閉和H_2O_2產(chǎn)生,而水楊羥污酸(SHAM,細(xì)胞壁過氧化物酶)則不起到抑制作用,表明褪黑素誘導(dǎo)的氣孔關(guān)閉依賴NADPH氧化酶介導(dǎo)的H_2O_2產(chǎn)生。異源三聚體GTP結(jié)合蛋白(G蛋白)通過調(diào)控NADPH氧化酶活性和H_2O_2產(chǎn)生調(diào)節(jié)植物的氣孔關(guān)閉,因此本研究隨后考察了G蛋白是否參與褪黑素誘導(dǎo)的氣孔關(guān)閉和H_2O_2產(chǎn)生。研究結(jié)果表明,褪黑素處理下外源添加G_α抑制劑GDP-βs降低了褪黑素誘導(dǎo)的氣孔關(guān)閉和H_2O_2產(chǎn)生,而G_α激活劑GTP-γs即使在沒有褪黑素的情況下也可以顯著誘導(dǎo)氣孔關(guān)閉和H_2O_2產(chǎn)生。由此可見,G蛋白α亞基是褪黑素信號傳導(dǎo)途徑中的關(guān)鍵組分,褪黑素通過G蛋白α亞基調(diào)節(jié)NADPH氧化酶介導(dǎo)的H_2O_2產(chǎn)生促進(jìn)氣孔關(guān)閉。2.以擬南芥突變體為材料,在分子遺傳層面進(jìn)一步揭示褪黑素誘導(dǎo)氣孔關(guān)閉的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑并鑒定植物首個可能的褪黑素受體。與蠶豆類似,褪黑素能夠誘導(dǎo)擬南芥H_2O_2產(chǎn)生和氣孔關(guān)閉,而CAT和DPI能夠抑制這個過程。與Col-0相比,NADPH氧化酶突變體rbohC和rbohD/F對褪黑素誘導(dǎo)的氣孔關(guān)閉不敏感,表明NADPH氧化酶介導(dǎo)的H_2O_2產(chǎn)生作為褪黑素的下游信號誘導(dǎo)植物氣孔關(guān)閉。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),G蛋白α亞基突變體gpα1-1和gpα1-2對褪黑素誘導(dǎo)的H_2O_2產(chǎn)生和Ca~(2+)流入不敏感,說明褪黑素誘導(dǎo)的氣孔關(guān)閉依賴G蛋白α亞基介導(dǎo)的H_2O_2和Ca~(2+)信號通路。由G蛋白/G蛋白偶聯(lián)受體介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑是真核細(xì)胞接受外界信號的保守機(jī)制。由于G蛋白參與褪黑素信號調(diào)控的氣孔關(guān)閉,因此推測植物中的G蛋白偶聯(lián)受體可能參與褪黑素信號的識別。本研究隨后分析了擬南芥cand2、cand7和gcr1-1等G蛋白偶聯(lián)受體突變體對褪黑素誘導(dǎo)的氣孔關(guān)閉的敏感性,以篩選可能的褪黑素受體。研究結(jié)果顯示,外源褪黑素誘導(dǎo)了Col-0、cand7和gcr1-1氣孔關(guān)閉。但是,cand2對褪黑素誘導(dǎo)的氣孔關(guān)閉不敏感,褪黑素誘導(dǎo)的Col-0中的氣孔關(guān)閉、H_2O_2產(chǎn)生和Ca~(2+)信號均在cand2突變體中被抑制。以上研究結(jié)果表明,CAND2參與褪黑素信號的識別,是一個可能的植物褪黑素受體。生物信息學(xué)和亞細(xì)胞定位分析結(jié)果表明,CAND2是一個可能具有七次跨膜α-螺旋結(jié)構(gòu)的膜蛋白。雙分子熒光互補(bǔ)實驗結(jié)果表明CAND2能夠與擬南芥中唯一的G蛋白α亞基(GPA1)特異性相互作用。GUS染色結(jié)果與熒光定量PCR顯示,AtCand2在保衛(wèi)細(xì)胞、子葉、芽、根等細(xì)胞和組織中廣泛表達(dá),且其表達(dá)程度受到的褪黑素水平的調(diào)節(jié)。以上研究結(jié)果表明,CAND2是一個可能的植物褪黑素受體,并被命名為植物褪黑素受體1(Phytomelatonin Receptor 1,PMTR1)。3.氣孔是植物光合作用氣孔交換的主要通道,也是蒸騰作用水分散失的主要途徑。植物吸收的水分95%通過氣孔擴(kuò)散到大氣中。因此,對氣孔開度的調(diào)節(jié)是降低水分散失和提高水分利用效率的有效途徑。為了進(jìn)一步研究褪黑素受體依賴的信號途徑在氣孔開度和干旱脅迫中的作用機(jī)理,本研究構(gòu)建了褪黑素受體PMTR1植物表達(dá)載體并獲得了過表達(dá)的轉(zhuǎn)基因擬南芥PMTR1-OX。研究結(jié)果表明,與Col-0相比,僅需0.1-1μmol/L褪黑素即可明顯誘導(dǎo)PMTR1-OX氣孔關(guān)閉和H_2O_2產(chǎn)生。且CAT或DPI均未能使PMTR1-OX中氣孔開度恢復(fù)至對照組的水平。說明PMTR1-OX對褪黑素的敏感程度更高,且作用程度更強(qiáng)。干旱脅迫能夠誘導(dǎo)植物內(nèi)源褪黑素水平的上升,因此本研究隨后考察了PMTR1在抗旱中的作用。在干旱處理14天后,PMTR1-OX的含水量約比Col-0高20%,干重是Col-0的1.2倍,而生物量的減少僅為Col-0的38%。表明與Col-0相比,PMTR1-OX表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗旱能力。這些結(jié)果有助于理解干旱脅迫下褪黑素及其受體的調(diào)控機(jī)理,為褪黑素作為一種新的植物激素提供證據(jù),并對其在農(nóng)作物水分高效利用與抗旱脅迫等方面的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：昆明理工大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：Q945
【圖文】：

昆明理工大學(xué)碩士學(xué)位論文7圖1.1干旱脅迫下ABA誘導(dǎo)的氣孔關(guān)閉信號途徑Fig1.1ABA-inducedstomatalclosuresignalpathwayunderdroughtstress1.1.2.6病原菌對氣孔運(yùn)動的調(diào)控機(jī)理植物表皮是病原體需要跨越的第一道屏障，氣孔是病原體跨越這道屏障，侵入植物葉片的主要途徑[46]。氣孔作為植物固有系統(tǒng)的一部分，能夠主動抵御病原體的侵入，這個過程是植物與生俱來的反應(yīng)，稱為固有免疫（Innateimmunity）。植物-病原體相互作用始于彼此的分子識別，植物一旦感知到細(xì)菌等病原體表面的病原體相關(guān)分子模式（Pathogen-associatedmolecularpatterns，PAMP），便會通過一系列信號級聯(lián)反應(yīng)關(guān)閉氣孔，從而增強(qiáng)對病原體的抗性，這一過程稱為氣孔防御（StomatalDefense）[47]。在細(xì)菌侵入葉片早期，保衛(wèi)細(xì)胞表面受體激酶（Flagellinsensitive2，F(xiàn)LS2）迅速感知細(xì)菌表面鞭毛蛋白（Flagellin22，flg22），介導(dǎo)質(zhì)膜中的NADPH氧化酶激活，從而誘導(dǎo)細(xì)胞中活性氧的迸發(fā)[48]。除此之外，這種植物固有免疫系統(tǒng)的觸發(fā)還會引起脂多糖（Lipopolysaccharides，LPS）誘導(dǎo)的NO產(chǎn)生、激活外流K+通道、激活鈣離子依賴型蛋白激酶以及上調(diào)植物免疫相關(guān)基因表達(dá)等一系列應(yīng)答，從而促使氣孔關(guān)閉，以阻止細(xì)菌的侵入[49,50]。在長期演化過程中，病原體也產(chǎn)生了抵御植物免疫系統(tǒng)的策略。丁香假單胞桿菌番茄致病變種（Pseudomonassyringaepv.tomatoDC3000,PstDC3000）是一種革蘭氏陰性菌，能夠引起各種植物免疫反應(yīng)，經(jīng)常在研究植物抗病中作為模式菌。PstDC3000能夠通過產(chǎn)生冠毒素（Coronatine，COR）來打破氣孔防御，在氣孔防御反應(yīng)發(fā)生一段時間后，誘導(dǎo)氣孔重新打開[51]。

昆明理工大學(xué)碩士學(xué)位論文9圖1.2G蛋白介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑模型Fig1.2Gprotein-mediatedsignaltransductionpathwaymodel1.2.2植物中G蛋白及G蛋白偶聯(lián)受體的種類脊椎動物中，G蛋白具有多樣性。例如，人類含有23種Gα亞基，5種Gβ亞基和12種Gγ亞基。二十世紀(jì)初，人們于擬南芥、水稻、玉米、小麥等多種高等植物中均發(fā)現(xiàn)G蛋白的存在[56]。與脊椎動物中G蛋白的多樣性相反，植物中的G蛋白種類較少。多數(shù)植物中只存在一種G蛋白α亞基，只有大豆、豌豆等少數(shù)植物中存在一種以上的G蛋白α亞基[57]。擬南芥中僅存在一種Gα亞基（GPA1），一種Gβ亞基（AGB1）和三種Gγ亞基（AGG1-AGG3）[53]。類似地，在植物中也僅鑒定了幾種GPCR樣蛋白，擬南芥中的GCR1具有最顯著的特征[58]。盡管如此，對已知典型的G蛋白亞基及其突變體或過表達(dá)植株的研究表明，G蛋白介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑參與了植物生長發(fā)育的多個過程，例如種子萌發(fā)、根系發(fā)育、形態(tài)建成、節(jié)律調(diào)節(jié)、響應(yīng)逆境脅迫等。

昆明理工大學(xué)碩士學(xué)位論文14DC3000的敏感性上升[109]。ASMT是植物褪黑素合成途徑中最主要的限速酶，2014年，Zuo等在蘋果中克隆出ASMT基因，命名為MzASMT1（KJ123721）。ASMT存在于細(xì)胞質(zhì)中，能夠受干旱脅迫的誘導(dǎo)表達(dá)，且與蘋果葉片中褪黑素的含量呈正相關(guān)。當(dāng)在擬南芥中過表達(dá)該基因時，轉(zhuǎn)基因擬南芥的褪黑素含量是野生型擬南芥的2~4倍，且體內(nèi)活性氧含量顯著降低，并提高了其對干旱脅迫的耐受性[110]。1.3.3植物褪黑素的功能圖1.4植物中褪黑素的功能Fig1.4Functionofmelatonininplants1.3.3.1褪黑素促進(jìn)植物根系的生長研究表明，褪黑素作為IAA類似物，能夠調(diào)控根系的生長發(fā)育，且其調(diào)控作用與褪黑素濃度相關(guān)。在低濃度時（≤10μmol/L）褪黑素能夠誘導(dǎo)羽扇豆側(cè)根和不定根的形成與生長，而高濃度褪黑素（≥100μmol/L）則會抑制其生長[93]。同樣的現(xiàn)象也在芥菜（BrassicajunceaL.）、金絲桃（HypericummonogynumL.）等植物中存在[111,112]，說明低濃度褪黑素促進(jìn)植物根系生長發(fā)育可能廣泛的存在于高等植物中。這一特征與IAA的功能相類似，且羽扇豆內(nèi)源的褪黑素與IAA有類似的組織分布，二者在根系生長發(fā)育中可能起到協(xié)同調(diào)控的作用[79]。2018年，Chen等系統(tǒng)的研究了外源褪黑素誘導(dǎo)側(cè)根生成的機(jī)制，在擬南芥中，過表達(dá)苜蓿MsSNAT基因，與野生型相比，轉(zhuǎn)基因擬南芥中H2O2含量顯著上升，誘導(dǎo)了

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本文編號：2768168