【摘要】：哈維氏弧菌隸屬于弧菌科中的弧菌屬,主要感染蝦及魚類,在海洋環(huán)境中分布范圍很廣,是海水中一種常見的病原菌,主要存在于自由水體、浮游動(dòng)植物體表、海底沉積物中。本研究中的磷脂酶D(phospholipase D,PLD)來源于致病菌哈維氏弧菌,通過同源建模發(fā)現(xiàn)它具有不同于其他PLD的獨(dú)特的結(jié)構(gòu)—C-末端突出一段肽鏈,且C-末端和N-末端肽鏈和其催化活性相關(guān)。因此,表征哈維氏弧菌磷脂酶D(VhPLD)的酶學(xué)性質(zhì)并揭示C-末端和N-末端肽鏈在酶活性發(fā)揮中的功能不僅有助于了解酶的結(jié)構(gòu)功能關(guān)系,為磷脂酶未來分子改造和工業(yè)化應(yīng)用奠定基礎(chǔ),同時(shí)為針對該酶進(jìn)行由哈維氏弧菌導(dǎo)致的病害防控均具有重要指導(dǎo)意義。本文以磷脂酶VhPLD為研究對象,采用大腸桿菌重組表達(dá)技術(shù)獲得重組表達(dá)VhPLD。在此基礎(chǔ)上,采用磷脂酰對硝基酚(PpNP)法和單分子層技術(shù)對其酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行分析;并通過設(shè)計(jì)和構(gòu)建C-末端和N-末端肽段缺失突變體,比較分析C-末端和N-末端肽缺失前后對磷脂酶VhPLD的酶學(xué)性質(zhì)的影響作用。具體研究內(nèi)容以及結(jié)果如下:(1)野生型VhPLD重組表達(dá)菌株的構(gòu)建及酶學(xué)性質(zhì)研究。首先,構(gòu)建了磷脂酶VhPLD大腸桿菌重組表達(dá)菌株pET21a-VhPLD SHuffle T7,通過誘導(dǎo)表達(dá)并經(jīng)Ni~(2+)親和層析、G25和Q柱陰離子交換層析得到了目的蛋白。其次,以PpNP為底物測定了其最適反應(yīng)條件。結(jié)果表明:VhPLD磷脂酶活性表現(xiàn)的最適反應(yīng)溫度為45℃,pH為8.0;苯對VhPLD-WT的酶活具有激活作用。最后,基于單分子層技術(shù)對其界面吸附特性進(jìn)行了研究。通過定點(diǎn)突變的方法,設(shè)計(jì)催化活性中心組氨酸突變體(VhPLD-H157A),避免水解對吸附過程的影響。以二肉豆蔻酰磷脂酰絲氨酸(DMPS)為底物時(shí),最大插入壓力(MIP)值最大,結(jié)果表明VhPLD-H157A對DMPS單分子層的結(jié)合能力最強(qiáng);用于研究酶蛋白的四種底物(二肉豆蔻酰磷脂酰膽堿(DMPC)、二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺(DMPE)、二肉豆蔻酰磷脂酰甘油(DMPG)和DMPS)單分子層的協(xié)同因子a均大于0,說明四種底物與酶蛋白存在正向的作用;四種底物的初始表面壓力增加值(ΔΠ_0)均大于其平衡表面壓力,進(jìn)一步證實(shí)酶蛋白更易從水下相遷移到到界面并與磷脂結(jié)合。(2)C-末端肽鏈對VhPLD的酶學(xué)性質(zhì)的影響研究。首先,成功構(gòu)建C-末端截?cái)嗟拇竽c桿菌重組表達(dá)菌株pET21a-VhPLD-Δ(472-483)SHuffle T7和pET21a-VhPLD-Δ(437-483)SHuffle T7,并獲得較純的目的蛋白。其次,以PpNP為底物測定了其最適反應(yīng)條件。結(jié)果表明:VhPLD-Δ(472-483)的最適溫度條件為50℃,VhPLD-Δ(437-483)酶活性的最適溫度條件為60℃;VhPLD-Δ(472-483)和VhPLD-Δ(437-483)的最適pH均為8.0;乙酸乙酯和乙醚對C-末端截?cái)嗤蛔凅w的酶活具有明顯的促進(jìn)作用。最后,單分子層技術(shù)實(shí)驗(yàn)表明:比較MIP值可知,肽鏈437-472的缺失對VhPLD與DMPE的界面結(jié)合有正面促進(jìn)的作用;比較協(xié)同因子a可知,肽鏈437-472則會促進(jìn)VhPLD與DMPE的結(jié)合;比較ΔΠ_0可知,表明肽鏈472-483和437-472的缺失均有利于其與DMPG的結(jié)合。(3)N-末端肽鏈對VhPLD的酶學(xué)性質(zhì)的影響研究。首先,成功構(gòu)建N-末端截?cái)啻竽c桿菌重組表達(dá)菌株pET21a-VhPLD-Δ(25-39)SHuffle T7,并獲得了較純的目的蛋白。其次,以PpNP為底物測定了其最適反應(yīng)條件。結(jié)果表明:VhPLD-Δ(25-39)的最適溫度條件為45℃,VhPLD-Δ(25-39)的最適pH為8.0;正己烷對N-末端截?cái)嗤蛔凅w的酶活具有促進(jìn)作用。最后,單分子層技術(shù)實(shí)驗(yàn)表明:比較MIP值可知,N-端肽鏈的缺失有助于VhPLD與DMPC和DMPG的界面結(jié)合;比較協(xié)同因子a可知,N-端肽鏈的缺失更有利于其與DMPE的結(jié)合;比較ΔΠ_0可知,N-端肽鏈的缺失更有利于其與DMPC的結(jié)合。
【學(xué)位授予單位】：華南理工大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：Q55;Q78
【圖文】：

及結(jié)構(gòu)研究概述究進(jìn)展經(jīng)在細(xì)菌、病毒、植物、真菌和哺乳動(dòng)物中鑒定了 PLD，并行分類。然而，在經(jīng)過若個(gè) PLD 基因的克隆和測序后，觀I-IV）[27]。保守基序 II 和 IV 包含重復(fù)的催化序列，HxKxxxHKD）。事實(shí)上，基序 I 和 II 以及 III 和 IV 之間存在顯著的核物種中內(nèi)部同源性和 1-HKD 基序酶的存在，又有相當(dāng)多致許多 PLD 超家族酶含有兩個(gè)保守的 HKD 基序[28]（圖 1D 基序的組氨酸殘基已被證明是負(fù)責(zé)啟動(dòng)磷酸二酯酶活性的功能“IYIENQFF”的高度保守序列組成。在催化的 HKD 基序已經(jīng)在高等真核生物中描述了其多堿性磷脂酰肌醇 4,5-二磷管 PLD 超家族成員的 C-末端不是同源的這一事實(shí)必須是催的突變或截短時(shí)活性會受到影響[29]。

中保守的 HKD 基序以藍(lán)色（N-末端基序）和紅色（C-末端基序）突出表圖 1-2 鏈霉菌屬 PMF PLD（PDB ID：1F0I）的晶體結(jié)構(gòu)[29]Fig. 1-2 Crystal structure of Streptomyces sp. PMF PLD (PDB ID:1F0I)菌 PLD 相反，由于重組酶的表達(dá)和純化困難，缺乏真核 PLD 結(jié)構(gòu)和機(jī)制在沒有高等真核 PLD 的晶體結(jié)構(gòu)的情況下，目前針對 PLD 機(jī)制的酶學(xué)理 PLD 的表征�；瘷C(jī)制研究進(jìn)展二酯水解通常不會在沒有金屬的情況下發(fā)生[41]。當(dāng)它發(fā)生時(shí)，機(jī)制必須通團(tuán)的親核攻擊進(jìn)行，這有利于磷酸二酯鍵的斷裂，并且通過酸催化進(jìn)行質(zhì)基團(tuán)能夠釋放。該反應(yīng)取決于初始親核試劑的來源，并可以用共價(jià)磷酸在單個(gè)步驟或兩個(gè)步驟中進(jìn)行。數(shù)十年的生物化學(xué)[30]、結(jié)構(gòu)[42]和生物物兩步法機(jī)制（圖 1-3），其中親核蛋白質(zhì)殘基與底物的磷酸基團(tuán)形成共價(jià)

圖 1-3 PLD 催化 PC 水解的反應(yīng)機(jī)理[43]Fig. 1-3 Reaction mechanism of PLD-catalyzed PC hydrolysis四十多年前，Yang 等人[44]和 Stanacev 等人[45]提出 PLD 催化通過兩步乒乓反應(yīng)機(jī)制與共價(jià)磷酸-蛋白質(zhì)中間體進(jìn)行。該假設(shè)基于在伯醇存在下對甘藍(lán) PLD 誘導(dǎo)的產(chǎn)物形成的分析。隨后水解和轉(zhuǎn)磷脂酰化平行進(jìn)行，此過程取決于水或醇的存在。早期的研究表明，半胱氨酸殘基的巰基可以作為親核殘基[44]，這是因?yàn)閷β燃谆郊姿狨ヌ幚硇揎椓擞坞x巰基并破壞了催化作用，在七個(gè)半胱氨酸殘基中含有大量 PLD。在 20 世紀(jì) 90 年代，用于表征 PLD 超家族反應(yīng)機(jī)制的其他研究試圖鑒定可能催化磷酸二酯酶活性的親核蛋白殘基。根據(jù) Ponting 等人[27]和 Koonin 等人[28]對 PLD 超家族成員中重復(fù)的 HKD 基序的觀察結(jié)果，有人提出親核殘基可能存在于該序列中。Sung 等人提出酵母 Spo14 / PLD1 的第二個(gè) HKD 基序中的保守絲氨酸殘基是親核試劑，該結(jié)論基于重組 Ser911Ala 突變體的研究，其突變導(dǎo)致催化活性顯著下降[46]。然而，隨后使用1-HKD 細(xì)菌酶[47]，Nuc 核酸內(nèi)切酶和 2-HKD 細(xì)菌 PLD[30]，耶爾森菌鼠毒素（YMT）

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前6條

1 王秀娟;高山;王國澤;;磷脂酶D的抗逆特性及其活性檢測研究[J];湖北農(nóng)業(yè)科學(xué);2014年05期

2 張紅宇;萬嗣寶;尹京苑;;低溫貯藏中桃果實(shí)磷脂酶D活性的測定[J];食品科技;2012年05期

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本文編號：2767990