【摘要】：七鰓鰻屬于原始的無頜類脊椎動物,是研究免疫起源與進(jìn)化的重要模式生物。本實驗室發(fā)現(xiàn)七鰓鰻體內(nèi)存在一種具有細(xì)胞毒性作用的蛋白分子,并命名為LIP(Lamprey Immune Protein)蛋白�，F(xiàn)已比較深入的了解到這種獨特蛋白的信息及功能,比如對多種癌細(xì)胞具有強(qiáng)烈的殺傷活性,并且對于正常細(xì)胞沒有殺傷現(xiàn)象,以及從多個角度證實了LIP蛋白能夠損傷腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞膜和細(xì)胞器,并明確了LIP蛋白作用腫瘤細(xì)胞的信號通路等,這就為LIP能夠作為治療腫瘤藥物提供了實驗基礎(chǔ)。天然活性的LIP蛋白是否有翻譯后修飾現(xiàn)象至今未知。本研究通過DIA蛋白質(zhì)組學(xué)定量技術(shù)檢測到LIP蛋白存在多種不同的修飾方式,在Asn286具有N-糖基化殘基修飾,在Ser295具有O-糖基化殘基修飾,為檢測糖基化位點的作用,將這兩個氨基酸均突變?yōu)锳la稱為第一號突變體LIPN286A和第二號突變體LIPS295A。為能夠深入探究LIP空間結(jié)構(gòu)方面的信息,隨后解析LIP蛋白結(jié)晶結(jié)構(gòu),通過數(shù)據(jù)收集、相位解析、分析數(shù)據(jù)后建模得出LIP蛋白結(jié)構(gòu)為P4_32_12空間群,分辨率為44.5~2.25?。LIP中存在一個與甘油分子穩(wěn)定結(jié)合的氫鍵網(wǎng)絡(luò),并發(fā)現(xiàn)Asp135殘基位于與配體結(jié)合的最中心位置,遂將這個氨基酸殘基突變?yōu)锳la作為第三號突變體LIP~(D135A),進(jìn)而確定這個殘基位點對LIP的空間構(gòu)造是否具有重要作用。LIP晶體結(jié)構(gòu)解析還顯示其具有Jacalin-like和Aerolysin兩個結(jié)構(gòu)域,將LIP通過與其結(jié)構(gòu)類似的斑馬魚氣單胞菌家族蛋白Dln1(Danio rerio aerolysin-like protein 1)同源建模后,發(fā)現(xiàn)二體相互作用面上的Met158、Phe229和Pro163、Phe227殘基彼此能夠形成氫鍵,將這四個氨基酸突變成半胱氨酸,期望在突變體中形成二硫鍵,此作為第四號突變體LIP~(M158C-F229C)和第五號突變體LIP~(P163C-F227C)。氨基酸序列比對和疏水性分析表明,LIP的一段氨基酸鏈(Phe209至Gly232)可形成兩個含有疏水親水殘基的兩親性β鏈,遂將這一氨基酸鏈去除作為第六號突變體LIP~(Ser212-Ala238)。通過圓二色譜和熒光光譜檢測LIP蛋白及六種突變體蛋白二級結(jié)構(gòu),發(fā)現(xiàn)它們都是以β片層為主,除突變體LIP~(Ser212-Ala238)變得更親水外,其它突變體二級結(jié)構(gòu)沒有較大差異。LDH檢測細(xì)胞活力實驗發(fā)現(xiàn)突變體LIP~(D135A)、LIP~(M158C-F229C)和LIP~(P163C-F227C)不能與癌細(xì)胞膜表面特異性結(jié)合并喪失了殺傷作用,結(jié)果說明二體相互作用面上彼此形成氫鍵的Met158、Phe229和Pro163、Phe227殘基和氫鍵網(wǎng)絡(luò)中心的Asp135殘基對于LIP蛋白特異性識別并殺傷癌細(xì)胞有重要作用;而LIP和LIP~(S295A)蛋白對MCF-7細(xì)胞顯示明顯的殺傷作用,在免疫熒光檢測結(jié)果中LIP、LIP~(N286A)和LIP~(S295A)蛋白均定位于HeLa細(xì)胞的細(xì)胞膜上,并且呈現(xiàn)熒光顆粒狀。免疫印跡結(jié)果顯示LIP、LIP~(N286A)和LIP~(S295A)蛋白以多聚體形式存在細(xì)胞膜上。突變體LIP~(S295A)和野生型LIP蛋白的活性相似度很高,說明Ser295位點的O-糖基化殘基的去除不影響LIP蛋白功能;突變體LIP~(N286A)保留與LIP蛋白可特異性結(jié)合細(xì)胞膜的這一功能下對細(xì)胞沒有明顯的殺傷作用,說明Asn286位點的N-糖基化殘基的去除能夠在不影響和細(xì)胞膜結(jié)合的情況下極大的減弱LIP的殺傷作用。值得注意的是,LIP~(N286A)突變體蛋白對MCF-7細(xì)胞不僅沒有明顯的殺傷作用,而且可以與細(xì)胞膜表面特異性結(jié)合,超高熒光顯微鏡結(jié)果表明LIP~(N286A)突變體蛋白與商品化的膜標(biāo)記染料Cholera Toxin Subunit B Cenjugates Alexa 555在細(xì)胞膜表面不完全重合,證明了可以將LIP~(N286A)突變體蛋白開發(fā)成為一種新型的細(xì)胞膜染料。
【學(xué)位授予單位】：遼寧師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：Q51
【圖文】：

圖 1.1 重組 LIP 作用不同種細(xì)胞的現(xiàn)象[10]Fig. 1.1 The phenomena of different cells with LIP（2）共聚焦顯微鏡檢測 LIP 在細(xì)胞定位情況將 LIP 蛋白孵育后的 MCF-7 與 HeLa 細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光實驗，可清晰的觀察到 LIP 均定位于兩種癌細(xì)胞的細(xì)胞膜上，標(biāo)記 LIP 蛋白的綠色熒光與標(biāo)記膜的紅色染料不完全重合。

圖 1.1 重組 LIP 作用不同種細(xì)胞的現(xiàn)象[10]Fig. 1.1 The phenomena of different cells with LIP（2）共聚焦顯微鏡檢測 LIP 在細(xì)胞定位情況將 LIP 蛋白孵育后的 MCF-7 與 HeLa 細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光實驗，可清晰的觀察到 LIP 均定位于兩種癌細(xì)胞的細(xì)胞膜上，標(biāo)記 LIP 蛋白的綠色熒光與標(biāo)記膜的紅色染料不完全重合。

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1 張珂嘉;七鰓鰻LIP蛋白晶體結(jié)構(gòu)解析和相關(guān)位點突變的活性鑒定[D];遼寧師范大學(xué);2019年

本文編號：2732813