【摘要】：胚胎干細胞(Embryonic stem cells,ESCs)具有自我更新和多向分化潛能,在科學研究和臨床醫(yī)學領域具有巨大的應用前景,但要實現(xiàn)其實際應用價值必須克服干細胞數(shù)量稀少的瓶頸問題,因此,亟需建立高效、可控的ESCs培養(yǎng)過程。為此,本文以鼠胚胎干細胞(Mouse embryonic stem cells,mESCs)為研究對象,首先考察了飼養(yǎng)層的制備方法、血清對mESCs擴增特性的影響。結果發(fā)現(xiàn):采用絲裂霉素處理制備的飼養(yǎng)層支持mESCs擴增效果優(yōu)于固定化飼養(yǎng)層;采用明膠代替飼養(yǎng)層同樣能支持mESCs穩(wěn)定擴增并維持未分化狀態(tài);培養(yǎng)基血清濃度達5%既能支持mESCs的擴增也能使其維持未分化狀態(tài),據(jù)此建立了以明膠為飼養(yǎng)層、血清替代物代替血清的mESCs的無血清培養(yǎng)體系,該體系中mESCs的擴增倍數(shù)可達到2.95±0.5倍,SSEA-1+細胞比例在80%以上。在此基礎上,分別考察了GSK3、MEK及FGFR抑制劑三類小分子化合物種類及相互作用對mESCs擴增及全能性維持的影響。結果發(fā)現(xiàn):與對照組相比,GSK3抑制劑(BIO及SB-216763)都能促進總細胞增殖,但會明顯降低SSEA-1+細胞的比例;MEK和FGFR抑制劑均有利于mESCs的擴增;GSK3抑制劑SB-216763與MEK抑制劑(PD184352、PD0325901)或FGFR抑制劑(SU5402)中的一種或二種組合均可以促進mESCs的擴增;特別是SB-216763+PD0325901+SU5402組合不僅能促進總細胞擴增,還能顯著提高SSEA-1+細胞比例,培養(yǎng)3代后總細胞擴增倍數(shù)和SSEA-1+細胞的比例可達318.78±47.95和80%以上明顯高于對照組的38.89±18.44和70%左右(p0.05)。其次,采用轉瓶在無血清培養(yǎng)體系中考察了mESCs在Cytodex3微載體上的擴增特性,培養(yǎng)到第5天時mESCs擴增倍數(shù)最大可達到31.68±7.74倍明顯高于靜態(tài)培養(yǎng)時的17.92±9.80(p0.05),SSEA-1+細胞比例在85%以上,且AKP染色及Oct4免疫熒光染色均呈陽性,實現(xiàn)了mESCs無血清無飼養(yǎng)層的動態(tài)懸浮培養(yǎng)。以上研究結果為胚胎干細胞的規(guī)模化制備技術的開發(fā)提供了依據(jù)。
【圖文】：

宄表明ＭＥＦ分泌的對ｍＥＳＣｓ起作用的細胞因子主要為ＬＩＦ，血清和ＬＩＦ同時作用可以維持逡逑ｍＥＳＣｓ的自我更新［２６］。逡逑ＬＩＦ的作用機制如圖１．１所示。培養(yǎng)基中添加ＬＩＦ后，ＬＩＦ可以與細胞膜上的受體逡逑ＬＩＦＲ／ｇｐｌ３０結合，從而激活細胞質內的ＪＡＫ邋（ｊａｎｕｓ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ邋ｋｉｎａｓｅ，邋ＪＡＫ），ＪＡＫa愃嶧義蝦蠼せ睿櫻裕粒裕常ǎ螅椋紓睿幔戾澹簦潁幔睿螅洌酰悖澹潁簀澹幔睿溴澹幔悖簦椋觶幔簦錚潁簀澹錚駑澹簦潁幔睿螅悖潁椋穡簦椋錚睿�，邋言ＡＴ３），枺藥F義系模櫻裕粒裕晨梢孕緯啥厶褰胂赴四詰鶻冢恚牛櫻茫蠖嗄芐曰虻謀澩錚鄭恚牛櫻茫蟮膩義銜捶只刺郟常擔蕁＃蹋桑樸胂赴ど系氖芴澹蹋桑疲遙紓穡歟常敖岷弦材芄患せ羆せ盍字＜〈跡常ゅ義廈福ǎ穡瑁錚螅穡瑁錚椋睿錚螅椋簦椋洌澹常耄椋睿幔螅�，，ＰＩ３Ｋ）信号通铝P保常叮�，ＰＩＫ３信号通路可壹sせ睿粒耍緣謀澩鎩ｅ義希校桑耍常粒耍孕藕磐房梢砸種鋪竊銑擅訃っ福沖澹ǎ牽歟悖錚紓澹鑠澹螅睿簦瑁幔螅邋澹耄椋睿幔螅澹常牽櫻耍常郟常貳�，辶x喜⒌鶻冢危幔睿錚緇虻謀澩錚保常福蕁５保危幔睿錚綣澩鍤�，可以促进ｍＥ衙ｓ哉啌]校蹋桑頻那榭魷亂插義夏芪治捶只刺郟常梗�。ＬＩＦ也能够激会悳O男藕磐罰紓停粒校耍牛遙誦藕磐罰傭義霞せ鍆廡藕諾鶻詡っ福ǎ牛簦潁幔悖澹歟歟酰歟幔蟈澹螅椋紓睿幔歟潁澹紓酰歟幔簦澹溴澹耄椋睿幔螅

本文編號：2708126