發(fā)布時間：2020-06-11 13:01

【摘要】：木質(zhì)素是由芳香化合物組成的天然生物高分子,其解聚產(chǎn)物在能源和化工領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用潛力,但復(fù)雜的抗性結(jié)構(gòu)限制了木質(zhì)素的高效解聚。最近研究發(fā)現(xiàn),木質(zhì)素C_α-OH化學(xué)氧化可以增強其解聚效率。而木質(zhì)素酶在木質(zhì)素碳循環(huán)中發(fā)揮關(guān)鍵作用,如果能利用木質(zhì)素酶選擇性氧化C_α-OH,將有望提供綠色溫和的木質(zhì)素解聚新策略。本論文以來源于Physisporinus vitreus和Echinodontium taxodii的三種木質(zhì)素酶-漆酶(Pv-Lac)、多功能過氧化物酶(Pv-VP)和錳過氧化物酶(Et-MnP)為研究對象,系統(tǒng)比較了其酶學(xué)性質(zhì),以及對酚型β-O-4二聚體模型化合物的C_α-OH氧化規(guī)律;在此基礎(chǔ)上,利用Pv-Lac氧化木質(zhì)素C_α-OH,以增強木質(zhì)素的甲酸催化解聚。分別從P.vitreus和E.taxodii胞外液中分離純化獲得Pv-Lac、Pv-VP和Et-MnP,研究其在不同pH條件下的酶學(xué)性質(zhì)和反應(yīng)動力學(xué)。結(jié)果顯示:Pv-Lac、Pv-VP、Et-MnP的最適pH分別為2.0、4.5、4.0。與過氧化物酶不同,Pv-Lac反應(yīng)最適pH和酶穩(wěn)定性最適pH有很大差異,酸性條件下Pv-Lac的催化活性強但穩(wěn)定性低,當(dāng)pH為7.0時,Pv-Lac表現(xiàn)出較高的穩(wěn)定性和底物親和力,但催化活性降低。H_2O_2濃度是影響Pv-VP催化的關(guān)鍵,Pv-VP可以氧化Et-MnP不能氧化的高氧化還原電位底物,而對于低氧化還原電位底物的催化效率低于Et-MnP。成功地合成木質(zhì)素二聚體模型化合物,并以酚型β-O-4二聚體研究側(cè)鏈C_α-OH的酶氧化規(guī)律。結(jié)果表明,當(dāng)pH為7.0時,Pv-Lac對酚型β-O-4二聚體的催化效率最高,二聚體側(cè)鏈的C_α-OH被選擇性氧化為C_α=O;而pH為3.0或4.5時,Pv-Lac對酚型β-O-4二聚體的催化效率減低,除發(fā)生輕微的C_α-OH氧化外,還聚合生成C-C鍵連接的四聚體。高濃度的H_2O_2增強過氧化物酶Pv-VP的催化速率,但導(dǎo)致其快速失活;過氧化物酶Et-MnP和Pv-VP催化酚型β-O-4二聚體發(fā)生輕微的C_α-OH氧化,同時聚合生成C-C鍵連接的四聚體。進一步研究了Pv-Lac氧化C_α-OH對甲酸催化解聚木質(zhì)素的影響。結(jié)果顯示,Pv-Lac氧化的酚型β-O-4二聚體經(jīng)甲酸催化解聚后,二聚體的解聚率從6.80 wt%顯著上升到36.33 wt%,主要的解聚產(chǎn)物為愈創(chuàng)木酚、香草醛、香草酸和愈創(chuàng)木基丙烷二酮;兩種木質(zhì)素高分子磨木木素(MWL)和堿木素經(jīng)Pv-Lac氧化后,氧化木質(zhì)素在甲酸作用下的解聚率分別為84.80 wt%和19.60 wt%,較未經(jīng)漆酶處理的對照分別增加24 wt%和9 wt%。綜上所述,本論文首次利用漆酶氧化木質(zhì)素C_α-OH,增強甲酸催化木質(zhì)素解聚的效率,為構(gòu)建生物改性偶聯(lián)化學(xué)氧化的木質(zhì)素解聚新策略奠定基礎(chǔ)。
【圖文】：

圖 1.3 漆酶活性位點結(jié)構(gòu)Fig. 1.3 Structure of fungal laccase active site究表明，Lac 的氧化修飾依賴于反應(yīng)條件（溫度、pH）[23, 24]，在不同 pH 條件下體現(xiàn)出不同的催化特性[25]，如圖 1.4 所示。經(jīng)歷 5 個狀態(tài)：靜止態(tài)（I）、還原態(tài)（R），過氧化態(tài)中間體（和氧化態(tài)（A）。當(dāng)存在底物時，Lac 將底物氧化奪得電子形成慢，是 Lac 氧化中的限速步驟；接下來還原態(tài)還原 O2形成過H 條件下，過氧化態(tài)中間體將通過兩個步驟進行衰減：相對快體，形成 X 態(tài)和氧化態(tài)；然后 X 態(tài)較慢的消耗，再形成過存在氧化態(tài)向靜止態(tài)（<1%, pH=7.0）的轉(zhuǎn)化，氧化態(tài)可以直應(yīng)速率很快，因此具有很高的氧化效率。在低 pH 條件下，過化態(tài)，通過兩步衰減：一部分依賴于 pH 轉(zhuǎn)化為靜止態(tài)（6.5），另一部分直接進行底物的催化。因此 pH 越低，氧化態(tài)轉(zhuǎn)

圖 1.4 漆酶的催化機理圖Fig. 1.4 Catalytic mechanism of fungal laccase的氧化還原電位為 0.5-0.8 V，主要取決于生物體的來源，到目前為Lac 的氧化還原電位最高（0.8 V）[13]。由于 Lac 的氧化電位比較低，木質(zhì)素中的酚類亞基。非酚類亞基具有更高的氧化還原電位，不能被非酚類結(jié)構(gòu)占木質(zhì)素的 80%以上[26]。漆酶作用于非酚類亞基的限制來克服。介體是一種作為漆酶和被氧化底物之間的電子載體的分子的氧化能力，，使 Lac-介體系統(tǒng)成為比 Lac 更強的氧化劑。同時介體被c 的氧化范圍，因為其分子量很小，可以擴散到木質(zhì)素內(nèi)部。介體一化合物和合成化合物。天然來源的介體為木質(zhì)素降解產(chǎn)物，如 4-羥和芥子酸等，因此天然介體的存在使漆酶的單一作用和與介質(zhì)結(jié)合。合成類介體包括 HBT（1-羥基苯并三唑）、ABTS（2,2'-聯(lián)氮-雙-3-6-磺酸鈉）、TEMPO（2,2,6,6-四甲基哌啶氧化物）和紫尿酸等[13]。因
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：Q505

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本文編號：2707946