【摘要】：研究背景創(chuàng)面愈合是燒創(chuàng)傷的基本問題,而促進(jìn)創(chuàng)面快速愈合是解決問題的關(guān)鍵。皮膚損傷后各種細(xì)胞會(huì)立即行動(dòng)起來保護(hù)創(chuàng)面組織并促進(jìn)愈合,這一過程的完成需要多組織,多細(xì)胞協(xié)調(diào)作用,其中再上皮化在創(chuàng)面愈合的全過程中都發(fā)揮著重要的作用。皮膚創(chuàng)面的再上皮化依賴于角質(zhì)形成細(xì)胞的遷移、增殖、分化等多種因素的綜合影響。研究表明創(chuàng)面損傷后由于大量細(xì)胞的活性被激活使得創(chuàng)面組織消耗大量的氧,導(dǎo)致創(chuàng)面處于低氧的微環(huán)境。且大量研究表明創(chuàng)面的低氧環(huán)境有利于表皮細(xì)胞的遷移和促進(jìn)創(chuàng)面愈合的作用,然而其潛在的調(diào)節(jié)機(jī)制依然不清楚。ADAM17是多結(jié)構(gòu)域跨膜金屬蛋白酶,其對(duì)細(xì)胞的遷移,粘附和細(xì)胞信號(hào)具有調(diào)節(jié)作用。在皮膚發(fā)育和體內(nèi)平衡過程中,ADAM17是調(diào)節(jié)許多細(xì)胞信號(hào)過程的基礎(chǔ)。然而其在皮膚表皮中的作用機(jī)制還未揭示。大量研究表明在創(chuàng)面愈合過程中,p38/MAPK促進(jìn)角質(zhì)細(xì)胞的遷移,且p38/MAPK受到低氧的激活。有研究指出p38可以通過調(diào)節(jié)ADAM17的磷酸化調(diào)節(jié)ADAM17活性和表達(dá)進(jìn)而介導(dǎo)ADAM17調(diào)節(jié)的細(xì)胞效應(yīng),那么在表皮細(xì)胞中ADAM17活性是否受到p38的調(diào)節(jié)進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞的遷移仍未可知。ADAM17作為跨膜金屬蛋白酶家族的一員,其在細(xì)胞中主要通過裂解膜分子的胞外域的脫落調(diào)節(jié)細(xì)胞的生理過程。表皮生長因子受體EGFR在皮膚的創(chuàng)面愈合中發(fā)揮著重要作用,有研究表明在ADAM17敲除的小鼠表型與EGFR缺失的表型類似,指出EGFR是ADAM17的基本基底,且二者對(duì)共同維持皮膚的完整發(fā)育具有重要的作用。EGFR表皮生長因子受體作用的發(fā)揮主要受到其配體EGF家族的激活與調(diào)節(jié)。EGF家族包括多個(gè)分子,其中TGF-α、HB-EGF、AREG主要由ADAM17調(diào)節(jié)。但是在低氧條件下,表皮細(xì)胞的遷移是否受到ADAM17裂解釋放EGFR配體的影響,此過程又是否受到p38/MAPK的調(diào)節(jié),這一重要的調(diào)節(jié)機(jī)制目前依然不夠明確。因此本研究將根據(jù)這一思路探究ADAM17在表皮細(xì)胞遷移中的作用機(jī)制。本研究提出低氧上調(diào)p38/MAPK信號(hào)途徑并激活A(yù)DAM17活性促進(jìn)EGF家族分子的釋放,進(jìn)而調(diào)控表皮細(xì)胞的遷移。通過檢測(cè)低氧條件下ADAM17對(duì)表皮細(xì)胞遷移的影響,并探討p38/MAPK對(duì)表皮細(xì)胞中ADAM17分子的活性及細(xì)胞遷移調(diào)節(jié)作用,從而明確ADAM17對(duì)低氧條件下促進(jìn)表皮細(xì)胞遷移的作用機(jī)制。研究方法1.制作體外表皮細(xì)胞促進(jìn)創(chuàng)面愈合的模型,模擬體內(nèi)創(chuàng)面損傷時(shí)組織愈合的低氧微環(huán)境,觀察常氧(21%O_2)和低氧(1%O_2:0h、6h、12h、24h)處理前后表皮細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)性和遷移以及ADAM17蛋白的表達(dá)和活性以及基底EGFR配體的變化規(guī)律;2.分別通過TAPI-2抑制表皮細(xì)胞ADAM17的活性和通過si RNA轉(zhuǎn)染技術(shù)沉默ADAM17蛋白表達(dá),然后對(duì)處理后的表皮細(xì)胞進(jìn)行劃痕以制作創(chuàng)面愈合模型,并進(jìn)一步將細(xì)胞放入低氧箱中模擬低氧環(huán)境(1%O_2)培養(yǎng)細(xì)胞相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)時(shí)間(12h),然后拍照統(tǒng)計(jì)細(xì)胞的創(chuàng)面愈合率和細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)。本實(shí)驗(yàn)首先通過藥物處理細(xì)胞并在特定的實(shí)驗(yàn)時(shí)間點(diǎn)收集細(xì)胞上清和提取總蛋白,然后分別用試劑盒和WB檢測(cè)ADAM17的抑制劑TAPI-2和si RNA轉(zhuǎn)染對(duì)其分子活性和蛋白表達(dá)的抑制及沉默作用;在處理后的實(shí)驗(yàn)時(shí)間點(diǎn)用顯微鏡記錄單層細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)?zāi)M的細(xì)胞愈合狀態(tài),觀察抑制ADAM17的分子活性對(duì)創(chuàng)面表皮細(xì)胞遷移的影響作用;另外,對(duì)處理過的表皮細(xì)胞在活細(xì)胞工作站下觀察單個(gè)表皮細(xì)胞的ADAM17表達(dá)下調(diào)對(duì)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性的影響;總之,分別從ADAM17的活性水平和蛋白水平表明其對(duì)低氧條件下表皮細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性的調(diào)控作用。3.分別用p38/MAPK的抑制劑SB203580和激酶MKK6處理表皮細(xì)胞,通過WB檢測(cè)低氧(1%O_2:12h)處理前后表皮細(xì)胞中p-p38/MAPK表達(dá)及p-p38/MAPK的底物MK-2的磷酸化水平變化,并檢測(cè)低氧條件下p38/MAPK下調(diào)和上調(diào)對(duì)表皮細(xì)胞ADAM17蛋白表達(dá)及活性的影響,最后通過劃痕實(shí)驗(yàn)和單細(xì)胞運(yùn)動(dòng)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)低氧條件下p38/MAPK的抑制劑SB203580和激酶MKK6處理對(duì)表皮細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性及遷移的影響,從而從細(xì)胞和分子兩個(gè)層面表明低氧條件下ADAM17對(duì)表皮細(xì)胞遷移的調(diào)控機(jī)制。結(jié)果1.24h內(nèi)不同時(shí)間的低氧處理都對(duì)表皮細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)性具有明顯的促進(jìn)作用,并且低氧顯著上調(diào)低氧轉(zhuǎn)錄因子HIF-1α的表達(dá)以及ADAM17的表達(dá)和活性,二者的表達(dá)規(guī)律成正相關(guān);2.使用ADAM17的抑制劑抑制ADAM17的活性和其特異性小干擾siRNA沉默其蛋白表達(dá),通過創(chuàng)面愈合模型劃痕實(shí)驗(yàn)和單個(gè)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)ADAM17的下調(diào)可明顯的抑制表皮細(xì)胞的的遷移,而且其可以對(duì)低氧促進(jìn)的表皮細(xì)胞遷移作用有效的逆轉(zhuǎn),表明低氧促進(jìn)的表皮細(xì)胞遷移受到解聚素金屬蛋白酶分子ADAM17的調(diào)控作用;3.p38/MAPK的活性受到低氧的激活,低氧條件下用p38/MAPK的抑制劑SB203580和激酶MKK6處理表皮細(xì)胞,可以顯著調(diào)節(jié)p38/MAPK的底物MK-2的磷酸化。并且和ADAM17的蛋白表達(dá)和活性也呈正相關(guān)。另外,抑制p38/MAPK的活性可以對(duì)低氧條件下的表皮細(xì)胞遷移產(chǎn)生顯著的抑制作用,而激活可以增強(qiáng)低氧的促進(jìn)作用。說明低氧條件下p38/MAPK通過促進(jìn)ADAM17信號(hào)通路來促進(jìn)表皮細(xì)胞的遷移。結(jié)論低氧促進(jìn)表皮細(xì)胞中p38/MAPK信號(hào)通路的激活,并上調(diào)ADAM17的表達(dá)和活性,從而促進(jìn)表皮細(xì)胞遷移;同時(shí)低氧通過低氧轉(zhuǎn)錄因子和p38/MAPK信號(hào)途徑上調(diào)了ADAM17翻譯水平的蛋白活性,但是轉(zhuǎn)錄水平基因的表達(dá)是否有變化仍未可知,而且有文獻(xiàn)表明p38/MAPK可以磷酸化ADAM17的胞質(zhì)區(qū)結(jié)構(gòu)域,所以低氧條件下的p38/MAPK是否也通過這一信號(hào)途徑,仍需要深入的探究。總之,本次的研究成果首次表明ADAM17在皮膚創(chuàng)面再上皮化中的作用,闡明其在表皮細(xì)胞遷移中的促進(jìn)作用機(jī)制,為深入研究調(diào)控創(chuàng)面愈合的作用機(jī)制提供了新的研究思路,并為臨床上治療創(chuàng)面疾病,加速創(chuàng)面愈合,解決創(chuàng)面損傷并發(fā)癥提供了新的可能治療靶點(diǎn)。
【圖文】：

第 1 章 低氧對(duì)表皮細(xì)胞遷移及 ADAM17 表達(dá)及活性的影響驗(yàn)結(jié)果CaT 細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果aCaT 表皮細(xì)胞株接種于 25cm2的培養(yǎng)瓶，細(xì)胞懸浮在培養(yǎng)基中呈顯的一圈光暈具良好的活性，然后將細(xì)胞靜置于培養(yǎng)箱中，十分培養(yǎng)基底部輕微貼壁，十小時(shí)后細(xì)胞大多伸出觸角半貼壁且呈半態(tài)，此時(shí)大部分細(xì)胞具扁平狀，胞膜邊界清楚，，核大,立體感較強(qiáng) 小時(shí)后細(xì)胞完全鋪展開，立體感變?nèi)酰N壁緊固，折光性變強(qiáng)。殖迅速相互接觸，細(xì)胞呈橢圓形，或者梭形,細(xì)胞增殖速度降低。圖 1-1。

結(jié)果顯示隨著低氧處理的時(shí)間延長細(xì)胞的遷移速率加快，創(chuàng)面愈合率也隨著增加。如圖1-2，統(tǒng)計(jì)不同條件處理細(xì)胞相同的時(shí)間的結(jié)果表明低氧條件下細(xì)胞的遷移明顯的高于常氧條件下細(xì)胞的遷移，低氧處理的細(xì)胞創(chuàng)面愈合面積同樣也大于常氧條件處理的細(xì)胞創(chuàng)面愈合面積（n=4,*P<0.05）。創(chuàng)面愈合面積=原始劃痕面積-X 小時(shí)后創(chuàng)面的面積創(chuàng)面愈合率=創(chuàng)面愈合面積/原始劃痕面
【學(xué)位授予單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：Q418

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