發(fā)布時間：2020-05-26 23:23

【摘要】：研究背景創(chuàng)面愈合是燒創(chuàng)傷的基本問題,而促進創(chuàng)面快速愈合是解決問題的關(guān)鍵。皮膚損傷后各種細胞會立即行動起來保護創(chuàng)面組織并促進愈合,這一過程的完成需要多組織,多細胞協(xié)調(diào)作用,其中再上皮化在創(chuàng)面愈合的全過程中都發(fā)揮著重要的作用。皮膚創(chuàng)面的再上皮化依賴于角質(zhì)形成細胞的遷移、增殖、分化等多種因素的綜合影響。研究表明創(chuàng)面損傷后由于大量細胞的活性被激活使得創(chuàng)面組織消耗大量的氧,導(dǎo)致創(chuàng)面處于低氧的微環(huán)境。且大量研究表明創(chuàng)面的低氧環(huán)境有利于表皮細胞的遷移和促進創(chuàng)面愈合的作用,然而其潛在的調(diào)節(jié)機制依然不清楚。ADAM17是多結(jié)構(gòu)域跨膜金屬蛋白酶,其對細胞的遷移,粘附和細胞信號具有調(diào)節(jié)作用。在皮膚發(fā)育和體內(nèi)平衡過程中,ADAM17是調(diào)節(jié)許多細胞信號過程的基礎(chǔ)。然而其在皮膚表皮中的作用機制還未揭示。大量研究表明在創(chuàng)面愈合過程中,p38/MAPK促進角質(zhì)細胞的遷移,且p38/MAPK受到低氧的激活。有研究指出p38可以通過調(diào)節(jié)ADAM17的磷酸化調(diào)節(jié)ADAM17活性和表達進而介導(dǎo)ADAM17調(diào)節(jié)的細胞效應(yīng),那么在表皮細胞中ADAM17活性是否受到p38的調(diào)節(jié)進而促進細胞的遷移仍未可知。ADAM17作為跨膜金屬蛋白酶家族的一員,其在細胞中主要通過裂解膜分子的胞外域的脫落調(diào)節(jié)細胞的生理過程。表皮生長因子受體EGFR在皮膚的創(chuàng)面愈合中發(fā)揮著重要作用,有研究表明在ADAM17敲除的小鼠表型與EGFR缺失的表型類似,指出EGFR是ADAM17的基本基底,且二者對共同維持皮膚的完整發(fā)育具有重要的作用。EGFR表皮生長因子受體作用的發(fā)揮主要受到其配體EGF家族的激活與調(diào)節(jié)。EGF家族包括多個分子,其中TGF-α、HB-EGF、AREG主要由ADAM17調(diào)節(jié)。但是在低氧條件下,表皮細胞的遷移是否受到ADAM17裂解釋放EGFR配體的影響,此過程又是否受到p38/MAPK的調(diào)節(jié),這一重要的調(diào)節(jié)機制目前依然不夠明確。因此本研究將根據(jù)這一思路探究ADAM17在表皮細胞遷移中的作用機制。本研究提出低氧上調(diào)p38/MAPK信號途徑并激活A(yù)DAM17活性促進EGF家族分子的釋放,進而調(diào)控表皮細胞的遷移。通過檢測低氧條件下ADAM17對表皮細胞遷移的影響,并探討p38/MAPK對表皮細胞中ADAM17分子的活性及細胞遷移調(diào)節(jié)作用,從而明確ADAM17對低氧條件下促進表皮細胞遷移的作用機制。研究方法1.制作體外表皮細胞促進創(chuàng)面愈合的模型,模擬體內(nèi)創(chuàng)面損傷時組織愈合的低氧微環(huán)境,觀察常氧(21%O_2)和低氧(1%O_2:0h、6h、12h、24h)處理前后表皮細胞的運動性和遷移以及ADAM17蛋白的表達和活性以及基底EGFR配體的變化規(guī)律;2.分別通過TAPI-2抑制表皮細胞ADAM17的活性和通過si RNA轉(zhuǎn)染技術(shù)沉默ADAM17蛋白表達,然后對處理后的表皮細胞進行劃痕以制作創(chuàng)面愈合模型,并進一步將細胞放入低氧箱中模擬低氧環(huán)境(1%O_2)培養(yǎng)細胞相應(yīng)的實驗時間(12h),然后拍照統(tǒng)計細胞的創(chuàng)面愈合率和細胞的運動。本實驗首先通過藥物處理細胞并在特定的實驗時間點收集細胞上清和提取總蛋白,然后分別用試劑盒和WB檢測ADAM17的抑制劑TAPI-2和si RNA轉(zhuǎn)染對其分子活性和蛋白表達的抑制及沉默作用;在處理后的實驗時間點用顯微鏡記錄單層細胞劃痕實驗?zāi)M的細胞愈合狀態(tài),觀察抑制ADAM17的分子活性對創(chuàng)面表皮細胞遷移的影響作用;另外,對處理過的表皮細胞在活細胞工作站下觀察單個表皮細胞的ADAM17表達下調(diào)對細胞運動性的影響;總之,分別從ADAM17的活性水平和蛋白水平表明其對低氧條件下表皮細胞運動性的調(diào)控作用。3.分別用p38/MAPK的抑制劑SB203580和激酶MKK6處理表皮細胞,通過WB檢測低氧(1%O_2:12h)處理前后表皮細胞中p-p38/MAPK表達及p-p38/MAPK的底物MK-2的磷酸化水平變化,并檢測低氧條件下p38/MAPK下調(diào)和上調(diào)對表皮細胞ADAM17蛋白表達及活性的影響,最后通過劃痕實驗和單細胞運動實驗檢測低氧條件下p38/MAPK的抑制劑SB203580和激酶MKK6處理對表皮細胞運動性及遷移的影響,從而從細胞和分子兩個層面表明低氧條件下ADAM17對表皮細胞遷移的調(diào)控機制。結(jié)果1.24h內(nèi)不同時間的低氧處理都對表皮細胞的運動性具有明顯的促進作用,并且低氧顯著上調(diào)低氧轉(zhuǎn)錄因子HIF-1α的表達以及ADAM17的表達和活性,二者的表達規(guī)律成正相關(guān);2.使用ADAM17的抑制劑抑制ADAM17的活性和其特異性小干擾siRNA沉默其蛋白表達,通過創(chuàng)面愈合模型劃痕實驗和單個細胞運動性實驗發(fā)現(xiàn)ADAM17的下調(diào)可明顯的抑制表皮細胞的的遷移,而且其可以對低氧促進的表皮細胞遷移作用有效的逆轉(zhuǎn),表明低氧促進的表皮細胞遷移受到解聚素金屬蛋白酶分子ADAM17的調(diào)控作用;3.p38/MAPK的活性受到低氧的激活,低氧條件下用p38/MAPK的抑制劑SB203580和激酶MKK6處理表皮細胞,可以顯著調(diào)節(jié)p38/MAPK的底物MK-2的磷酸化。并且和ADAM17的蛋白表達和活性也呈正相關(guān)。另外,抑制p38/MAPK的活性可以對低氧條件下的表皮細胞遷移產(chǎn)生顯著的抑制作用,而激活可以增強低氧的促進作用。說明低氧條件下p38/MAPK通過促進ADAM17信號通路來促進表皮細胞的遷移。結(jié)論低氧促進表皮細胞中p38/MAPK信號通路的激活,并上調(diào)ADAM17的表達和活性,從而促進表皮細胞遷移;同時低氧通過低氧轉(zhuǎn)錄因子和p38/MAPK信號途徑上調(diào)了ADAM17翻譯水平的蛋白活性,但是轉(zhuǎn)錄水平基因的表達是否有變化仍未可知,而且有文獻表明p38/MAPK可以磷酸化ADAM17的胞質(zhì)區(qū)結(jié)構(gòu)域,所以低氧條件下的p38/MAPK是否也通過這一信號途徑,仍需要深入的探究�？傊�,本次的研究成果首次表明ADAM17在皮膚創(chuàng)面再上皮化中的作用,闡明其在表皮細胞遷移中的促進作用機制,為深入研究調(diào)控創(chuàng)面愈合的作用機制提供了新的研究思路,并為臨床上治療創(chuàng)面疾病,加速創(chuàng)面愈合,解決創(chuàng)面損傷并發(fā)癥提供了新的可能治療靶點。
【圖文】：

第 1 章 低氧對表皮細胞遷移及 ADAM17 表達及活性的影響驗結(jié)果CaT 細胞培養(yǎng)結(jié)果aCaT 表皮細胞株接種于 25cm2的培養(yǎng)瓶，細胞懸浮在培養(yǎng)基中呈顯的一圈光暈具良好的活性，然后將細胞靜置于培養(yǎng)箱中，十分培養(yǎng)基底部輕微貼壁，十小時后細胞大多伸出觸角半貼壁且呈半態(tài)，此時大部分細胞具扁平狀，胞膜邊界清楚，，核大,立體感較強 小時后細胞完全鋪展開，立體感變?nèi)�，貼壁緊固，折光性變強。殖迅速相互接觸，細胞呈橢圓形，或者梭形,細胞增殖速度降低。圖 1-1。

結(jié)果顯示隨著低氧處理的時間延長細胞的遷移速率加快，創(chuàng)面愈合率也隨著增加。如圖1-2，統(tǒng)計不同條件處理細胞相同的時間的結(jié)果表明低氧條件下細胞的遷移明顯的高于常氧條件下細胞的遷移，低氧處理的細胞創(chuàng)面愈合面積同樣也大于常氧條件處理的細胞創(chuàng)面愈合面積（n=4,*P<0.05）。創(chuàng)面愈合面積=原始劃痕面積-X 小時后創(chuàng)面的面積創(chuàng)面愈合率=創(chuàng)面愈合面積/原始劃痕面
【學(xué)位授予單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：Q418

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本文編號：2682560