【摘要】：實(shí)驗(yàn)室前期從冰島硫化葉菌(Sulfolobus islandicus REY115A)中發(fā)現(xiàn)并鑒定了一種新型ATP酶,命名為SisPINA,它能夠在體外驅(qū)動(dòng)Holliday junction DNA(HJ)遷移,與HJ特異性核酸內(nèi)切酶Hjc具有物理上和功能上的相互作用,并協(xié)調(diào)HJ加工。結(jié)構(gòu)分析表明ATP的結(jié)合和水解會(huì)引起SisPINA構(gòu)象發(fā)生變化,促進(jìn)HJ分支遷移(branch migration)。然而,SisPINA在HJ加工和處理中如何與其它蛋白協(xié)同發(fā)揮作用以及它參與古菌同源重組修復(fù)的具體過程還不太清楚,因此,我們需要更多的生物化學(xué)、結(jié)構(gòu)和功能研究來充分了解該蛋白質(zhì)的性質(zhì),并揭示古菌中同源重組修復(fù)的機(jī)制。為了進(jìn)一步拓展SisPINA的功能,我們首先通過Pull-down分析和分子篩驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)SisPINA和SisHjm具有很強(qiáng)的物理相互作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果還顯示SisPINA羧基端II-KH結(jié)構(gòu)域是與其它蛋白相互作用的重要部位,而SisHjm的第五個(gè)結(jié)構(gòu)域不是它與SisPINA相互作用的部位。目前已有很多關(guān)于古菌蛋白甲基化修飾的報(bào)道,其中賴氨酸的甲基化修飾方面的研究較多,如嗜酸熱S.acidocaldarius中的鐵氧還原蛋白,硫磺礦S.solfataricus中的谷氨酸脫氫酶、β-糖苷酶、核糖體蛋白L11、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶、Sso7d2和RFC大、小亞基,冰島硫化葉菌S.islandicus中的Cren7和Sso7d等都發(fā)生不同程度的甲基化修飾。甲基化修飾在古菌中廣泛存在,暗示甲基化修飾在古菌中具有重要生理作用。我們嘗試鑒定SisPINA在細(xì)胞內(nèi)的翻譯后修飾。冰島硫化葉菌本底水平表達(dá)的SisPINA的質(zhì)譜驗(yàn)證結(jié)果顯示,在正常生理?xiàng)l件下SisPINA在細(xì)胞內(nèi)發(fā)生磷酸化和甲基化修飾,甲基化修飾主要發(fā)生在羧基端的賴氨酸(K474、K479、K498和K500)。前期證明羧基端參與蛋白間的相互作用,我們驗(yàn)證該區(qū)域的修飾是否調(diào)控與其它蛋白的相互作用或具有其他功能。過表達(dá)賴氨酸位點(diǎn)突變PINA(K474A/K479A/K498A/K500A)菌株生長曲線表明甲基化修飾不影響蛋白的生長速率。差式量熱分析(DSC)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)SisPINA蛋白甲基化修飾不影響蛋白的熱穩(wěn)定性。通過等溫滴定量熱法(ITC)定量測定模擬甲基化修飾的SisPINA蛋白(K474M/K479M/K498M/K500M)與其他蛋白結(jié)合力時(shí)發(fā)現(xiàn)滴定曲線很平緩,有可能是蛋白濃度過低導(dǎo)致,但當(dāng)我們提高蛋白濃度時(shí),發(fā)現(xiàn)蛋白會(huì)發(fā)生沉淀,因此我們需要其他方法來定量測定蛋白間的結(jié)合力。體外甲基化反應(yīng)后質(zhì)譜鑒定發(fā)現(xiàn),甲基化轉(zhuǎn)移酶aKMT蛋白可以甲基化SisPINA蛋白,但在體外用Pull-down和分子篩分析兩者相互作用時(shí),發(fā)現(xiàn)兩者并沒有相互作用,可能是兩者在體內(nèi)只發(fā)生功能性的結(jié)合。我們利用Pull-down實(shí)驗(yàn)來檢測SisPINA野生型蛋白和甲基化模擬蛋白與Hjm、RFCs的相互作用時(shí)發(fā)現(xiàn),與野生型SisPINA蛋白相比,SisPINA甲基化模擬蛋白失去了與RFCs和Hjm的相互作用,可能初步說明甲基化修飾會(huì)抑制蛋白間的相互作用。接著我們將這四個(gè)賴氨酸位點(diǎn)突變?yōu)楸彼?Pull-down實(shí)驗(yàn)表明,SisPINA(K474A/K479A/K498A/K500A)和 Hjm(RFCs)也沒有相互作用,說明這四個(gè)賴氨酸位點(diǎn)是蛋白間相互作用的重要部位,之后為了進(jìn)一步確定準(zhǔn)確的相互作用部位,我們分別純化了賴氨酸單突變體蛋白,利用Pull-down實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證單個(gè)位點(diǎn)突變對蛋白間相互作用的影響,發(fā)現(xiàn)單突變體不影響蛋白間的相互作用,說明四個(gè)賴氨酸位點(diǎn)協(xié)同影響蛋白間的相互作用。甲基化修飾是否是SisPINA在細(xì)胞內(nèi)行使功能必需的,甲基化修飾對SisPINA細(xì)胞內(nèi)功能的影響還需要進(jìn)一步的研究。我們分析了廣古菌Thermococcus kodakaraensis KOD1基因組編碼SisPINA的同源物序列,發(fā)現(xiàn)T.kodakaraensis中編碼PINA蛋白的序列位于CRISPR序列附近,且CRISPR序列潛在可以形成HJ結(jié)構(gòu),猜測TkoPINA(Tko 0953)可能參與CRISPR相關(guān)功能。雖然實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)TkoPINA與CRISPR序列具有很強(qiáng)的結(jié)合活性,但與其它單鏈DNA、雙鏈DNA和HJ也有很強(qiáng)的結(jié)合活性。接下來我們利用Pull-down檢測了 TkoPINA蛋白與鄰近蛋白的相互作用,發(fā)現(xiàn)TkoPINA蛋白與GTP酶(Tko 0951)具有很強(qiáng)的結(jié)合能力,而與膜位點(diǎn)決定蛋白MinD(Tko 0952)、膜形成抑制蛋白Maf(Tko 0954)(兩者與細(xì)胞分裂有關(guān))無明顯相互作用。體外生化實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)MinD具有內(nèi)切酶活性,且TkoPINA可以抑制MinD的內(nèi)切酶活性,但兩者在體內(nèi)的作用機(jī)制還不太清楚。
【圖文】：

這些連接也可以通過解旋酶－拓?fù)洚悩?gòu)酶復(fù)合物逡逑（ＢＬＭ－Ｔｏｐｏｌｌｌａ－ＲＭＩＩ－ＲＭ１２）降解從而產(chǎn)生非交叉產(chǎn)物�？偠灾�，重組是一逡逑種非常復(fù)雜的反應(yīng)多種酶活性，，可在許多方面進(jìn)行調(diào)節(jié)（圖１－４）邋［１５１。逡逑５逡逑

螺旋和包裝在其表面的反平行（３片。真核１型和原核ＩＩ型ＫＨ結(jié)構(gòu)域都有一個(gè)最逡逑小的Ｐ0ｔａ（３核心，具有兩個(gè)額外的ａ和卩元素位于Ｃ末端（丨型，真核生物）或Ｎ逡逑末端（１１型，原核生物）（圖１－１邋ｌａ）邋［８２］。在所有ＫＨ結(jié)構(gòu)域－核酸復(fù)合體結(jié)構(gòu)逡逑中，核酸骨架與保守的ＧｘｘＧ相互作用，與最小ＫＨ中心的的螺旋聯(lián)系起來。四逡逑個(gè)核酸堿基朝向蛋白質(zhì)凹槽的疏水相互作用和氫鍵主鏈和側(cè)鏈結(jié)構(gòu)中從而介導(dǎo)逡逑核堿基識別（圖１－ｌｌｂ，邋ｃ）。目前，具有經(jīng)典ＫＨ折疊但缺乏保守ＧｘｘＧ基序的逡逑１８逡逑
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：Q936

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本文編號：2665217