【摘要】：裂解性多糖單加氧酶(Lytic polysaccharide monooxygenase,LPMO)是最近發(fā)現(xiàn)的一類新型單銅氧化酶,通過(guò)氧化裂解多糖底物,增強(qiáng)糖苷水解酶(Glycoside Hydrolases,GH)對(duì)多糖的水解效率。LPMO分布廣泛,在細(xì)菌、古菌、真菌和昆蟲中均有報(bào)道,但不同生境微生物L(fēng)PMO的性質(zhì)比較和功能研究少見報(bào)道。本論文以放線菌、腸道細(xì)菌和古菌的AA10家族LPMO為研究對(duì)象,通過(guò)異源表達(dá)獲得三種不同來(lái)源的LPMO,比較其酶學(xué)性質(zhì)差異并鑒定其對(duì)幾丁質(zhì)的氧化活性,在此基礎(chǔ)上,對(duì)LPMO在天藍(lán)色鏈霉菌幾丁質(zhì)降解過(guò)程中的功能進(jìn)行同源驗(yàn)證。首先,從Streptomyces coelicolor(天藍(lán)色鏈霉菌,放線菌)、Enterococcus faecalis(糞腸球菌,腸道細(xì)菌)和Natrialbaceae archaeon(古菌)中獲得三個(gè)AA10家族LPMO基因,構(gòu)建大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng),獲得三個(gè)LPMO重組蛋白:ScLPMO10G、Ef LPMO10B、NaLPMO10A,其氨基酸序列和蛋白結(jié)構(gòu)與典型的AA10家族LPMO的同源性較高。其次,比較了三種LPMO的酶學(xué)特性,發(fā)現(xiàn)其均具有幾丁質(zhì)氧化活性,ScLPMO10G、Ef LPMO10B、Na LPMO10A對(duì)幾丁質(zhì)酶的水解效率分別提高50.93%、48.74%、50.11%。三種LPMO的最適反應(yīng)溫度、pH和穩(wěn)定性不同,其中,古菌N.archaeon來(lái)源的Na LPMO10A在較高溫度(60℃)、高pH(pH 10.0)及高濃度Na~+(1 mol/L)條件下的穩(wěn)定性較好,在1 mol/L Na~+溶液中保溫8 h仍有70%以上的相對(duì)酶活。最后,成功構(gòu)建了過(guò)表達(dá)ScLPMO10E和ScLPMO10G的天藍(lán)色鏈霉菌菌株ScΔ10E(+)和ScΔ10G(+),并實(shí)現(xiàn)了LPMO的過(guò)表達(dá);以幾丁質(zhì)為唯一碳源生長(zhǎng)時(shí),ScΔ10E(+)和ScΔ10G(+)的胞外還原糖含量、胞外總幾丁質(zhì)酶活以及胞外酶系對(duì)幾丁質(zhì)的酶解效率均顯著高于野生型菌株,幾丁質(zhì)酶解效率分別提高81.79%和224.74%,表明LPMO在鏈霉菌的幾丁質(zhì)降解中發(fā)揮重要作用。本文首次對(duì)不同生境微生物的LPMO性質(zhì)進(jìn)行比較研究,并對(duì)LPMO在天藍(lán)色鏈霉菌幾丁質(zhì)降解過(guò)程中功能進(jìn)行了同源驗(yàn)證,為L(zhǎng)PMO的綜合利用和生物質(zhì)的高效降解提供指導(dǎo),也為揭示LPMO的生物學(xué)功能奠定了基礎(chǔ)。
【圖文】：

圖 1.1 LPMO 的分布和分類Figure 1.1 Distribution and classification of LPMOAA9 家族包含約 2500 個(gè)注釋序列，其總體序列同源性偏低，系統(tǒng)發(fā)育分析進(jìn)一步分為三個(gè)亞家族[25, 26]。序列同源性研究表明，，盡管大多數(shù)序列由單個(gè)結(jié)構(gòu)域組成，但其中約 20％含有 C 端接頭和 CBM1 模塊，CBM1 模塊是真素結(jié)合域。AA10 家族含有兩個(gè)系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化分枝，其區(qū)別在于它們對(duì)幾丁質(zhì)或纖維素異性[25]。Vu 等[27]認(rèn)為，不同底物特異性的 AA10 酶之間具有活性位點(diǎn)差異 AA10 家族進(jìn)一步分成兩個(gè)亞家族，其中大部分 AA10 家族成員具有幾丁性。AA10 家族同樣具有 CBM，其結(jié)構(gòu)的多樣性比 AA9 家族更豐富[14]。已知的 AA11 家族序列包含了在 AA9 和 AA10 家族中所發(fā)現(xiàn)的活性位點(diǎn)特通過(guò)生物信息學(xué)分析進(jìn)一步分成兩個(gè)亞家族[28]，目前僅確定了其中較大一幾丁質(zhì)底物特異性[29]。Voshol等開展了基因組挖掘工作后，確定了AA14家族

圖 1.2AA9 家族和 AA10 家族 LPMO 的蛋白結(jié)構(gòu)圖[14] Protein structure of early published LPMO of theAA9 family and cus aurantiacus 來(lái)源的 AA9 家族 LPMO，TaLPMO9A(TaGH61A的 AA10 家族 LPMO，SmLPMO10A(CBP21)；（C）（D）分別SmLPMO10A 的活性位點(diǎn)昆蟲 Thermobia domestica（斑衣魚）TdAA15A 的結(jié)構(gòu)研的表面上有兩個(gè)幾乎共面的酪氨酸殘基暴露出來(lái)，這個(gè)十分重要。此外，在許多 AA9 家族 LPMO 的組氨酸支架香族氨基酸殘基，通常是酪氨酸（Tyr），而在 AA10 家具有幾丁質(zhì)底物特異性的 AA15 家族 LPMO，其蛋白結(jié)支架的苯丙氨酸殘基。的模塊化結(jié)構(gòu)知 3D 結(jié)構(gòu)的 LPMO 是單結(jié)構(gòu)域的酶，但也有例外。如來(lái)霉）的 HjLPMO9A 以及來(lái)自 Aspergillus oryzae（米曲霉
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：Q55

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本文編號(hào)：2653917