【摘要】：蛋白酶是能將蛋白質(zhì)降解為小肽和氨基酸的水解酶,堿性蛋白酶(Alkaline protease,AP)作為在堿性環(huán)境下活力較高、穩(wěn)定性較好的一類蛋白酶,其在洗滌劑、生物修復(fù)、廢物管理、攝影、診斷等工業(yè)中均有應(yīng)用。微生物源堿性蛋白酶因生產(chǎn)成本低、生產(chǎn)率高可滿足工業(yè)上的需求,成為堿性蛋白酶生產(chǎn)的重要來源,在微生物中,細(xì)菌和真菌是各種堿性蛋白酶的良好來源。目前,芽孢桿菌屬細(xì)菌如枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、嗜堿性芽孢桿菌等是適用于工業(yè)生產(chǎn)的主要產(chǎn)酶菌株。本文主要從自然環(huán)境中篩選出一株產(chǎn)酶活性較高的菌株,并對(duì)菌株中堿性蛋白酶進(jìn)行了相關(guān)研究。首先,從自然發(fā)酵的大豆中分離出一株產(chǎn)蛋白酶活性較高的菌株BN-2,結(jié)合形態(tài)學(xué)、分子生物學(xué)鑒定該菌種為Bacillus subtilis subsp.natto BEST195。然后通過CTAB法成功提取了BN-2菌株中基因組DNA,利用PCR技術(shù)擴(kuò)增出該菌株中堿性蛋白酶(Alkaline protease,AP)基因,插入pBE2R載體中,構(gòu)建成重組表達(dá)載體pBE2R-AP,并轉(zhuǎn)染枯草芽孢桿菌WB600進(jìn)行分泌性表達(dá)。以糊精、可溶性淀粉作為碳源,每毫升發(fā)酵液中重組蛋白酶的酶活約是出發(fā)菌株中蛋白酶酶活的1.2倍。將pBE2R載體中p43啟動(dòng)子替換為BN-2菌株中堿性蛋白酶的p195啟動(dòng)子時(shí),每毫升發(fā)酵液中p43啟動(dòng)子調(diào)控下的堿性蛋白酶酶活約是p195啟動(dòng)子調(diào)控下酶活的1.4倍。以酪蛋白為底物對(duì)該重組蛋白酶的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了研究,結(jié)果表明:該酶的最適作用pH為8.0,在pH 8.0緩沖液中保存24 h,剩余酶活力達(dá)94%;該酶的最適作用溫度為50℃,在50℃中處理30min時(shí)殘余酶活力降至51%;1mmol/L的Mn~(2+)使該酶活性提高了48%,1mmol/L的Ca~(2+)使該酶活性提高了8%;洗滌劑組分中1%的TritonX-100對(duì)該酶活性有13%的抑制作用,1%的Tween20對(duì)該酶活性有8%的抑制作用,1%的Tween80對(duì)該酶活性有15%的抑制作用。
【圖文】：

由于其對(duì)蛋白質(zhì)底物作用位點(diǎn)不同，可分為一步可分為六類不同蛋白酶[3]。其中絲氨酸蛋白酶中絲氨酸是其必需的催化殘基。絲氨酸蛋同源性分為胰凝乳蛋白酶樣蛋白酶、脯氨�；←溄z氨酸羧肽酶Ⅱ樣蛋白酶、粘桿菌溶菌酶枯草桿菌素樣蛋白酶又因氨基酸序列的不、嗜熱蛋白酶（Thermitase）、蛋白酶 K（Prootic peptidase）、克辛 （Kexin）和吡咯（Py]�？莶輻U菌素（Subtilisin）又包括六個(gè)亞家族、胞內(nèi)蛋白酶、高分子量枯草桿菌素(HMSs)[5]。最適反應(yīng) pH 值的不同，又可分為堿性、中性

圖 1.2 酶的銷售分布Fig1.2 Distribution of enzyme sales.酶在洗滌劑中的應(yīng)用酶作為洗滌添加劑，加入洗衣粉和餐具洗滌劑中，，有漬，如角蛋白、牛奶、醬汁和肉汁等。使用堿性蛋白危害化學(xué)品如含磷化合物的使用，同時(shí)減輕了環(huán)境酶應(yīng)該在洗滌劑成分例如表面活性劑，助洗劑，漂白物柔軟劑和其它各種配方助劑的存在下是穩(wěn)定和有活水解酶，在水解自身時(shí)也會(huì)分解產(chǎn)品中其他酶，因此在于有效抑制酶活性，希望在產(chǎn)品貯存過程中抑制酶活力，硼酸和丙二醇體系作為洗滌劑產(chǎn)品中常用的將 4-FPBA 作為抑制蛋白酶酶活的主要試劑[49-53]。目洗滌劑的商品化酶制劑，已經(jīng)成為洗滌劑產(chǎn)品中必酶在食品中的應(yīng)用
【學(xué)位授予單位】：山西大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：Q78;Q55

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10 那淑敏;余茂R

本文編號(hào)：2650790