發(fā)布時(shí)間：2020-05-05 15:47

【摘要】：L-丹參素(L-DSS)是一種極具生理活性和藥用價(jià)值的水溶性酚酸類化合物,以抗血栓、抗氧化、抗菌消炎、降血脂、改善微循環(huán)等顯著藥理作用,在預(yù)防和治療心腦血管疾病方面有著廣闊的開發(fā)前景。此外,它還是合成多種手性物質(zhì)和生物活性物質(zhì)的重要中間體。自然界中不存在L-丹參素,從植物丹參中分離得到的是它的對映異構(gòu)體D-丹參素。對D-和L-丹參素的藥理活性和強(qiáng)度進(jìn)行比較,發(fā)現(xiàn)它們具有相同的藥理活性,且L-丹參素的藥學(xué)強(qiáng)度更加突出。近年來,陸續(xù)出現(xiàn)了化學(xué)合成L-丹參素的報(bào)道,但由于其存在污染嚴(yán)重、操作繁瑣、成本高、產(chǎn)物光學(xué)純度差、合成效率低等缺點(diǎn),很大程度上受到了工業(yè)化應(yīng)用的限制。因此,有必要探索出一條綠色安全、操作簡單、效率高、成本低廉的合成單一手性L-丹參素的生物途徑。研究表明,乳酸脫氫酶能立體選擇性還原α-酮酸生成α-羥基羧酸,這為L-丹參素的生物合成提供了參考依據(jù)。本研究將L-乳酸脫氫酶和葡萄糖脫氫酶基因進(jìn)行共表達(dá),全細(xì)胞催化底物3,4-二羥基苯丙酮酸、葡萄糖生產(chǎn)L-丹參素。主要研究成果如下:(1)從實(shí)驗(yàn)室保藏的20株乳酸菌中篩選了一株具有較高3,4-二羥基苯丙酮酸還原活性的發(fā)酵乳桿菌(Lactobacillus fermentum JN248)。通過對同菌屬的Lactobacillus fermentum F-6的全基因組進(jìn)行分析,從L.fermentum JN248中克隆到了5個(gè)L-乳酸脫氫酶基因(lf-l-ldh0845、lf-l-ldh1566、lf-l-ldh1732、lf-l-ldh0611和lf-l-ldh0372,蛋白分子量為32~34 kDa),連接到質(zhì)粒pETDuet-1上,并導(dǎo)入大腸桿菌中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。對純化前后的酶液進(jìn)行SDS-PAGE分析和酶活力檢測,發(fā)現(xiàn)這5個(gè)酶在理論蛋白分子量處都出現(xiàn)明顯條帶,且LF-L-LDH0845的酶活力最強(qiáng)。(2)對LF-L-LDH0845的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行研究,結(jié)果發(fā)現(xiàn):LF-L-LDH0845在pH6.0時(shí)活性最高且最穩(wěn)定;最適溫度為25℃,在10-25℃時(shí)穩(wěn)定性較好;具有廣泛的底物作用范圍,最適底物為丙酮酸,其次為苯丙酮酸;對3,4-二羥基苯丙酮酸的K_m、K_(cat)、K_(cat)/K_m分別為11.3709 mM、0.2931 S~(-1)、0.0258 mM~(-1)·S~(-1)。(3)利用來源于枯草芽孢桿菌的葡萄糖脫氫酶與LF-L-LDH0845一起構(gòu)建了大腸桿菌BL21(DE3)/pETDuet-1-ldh-gdh雙酶共表達(dá)菌株,以實(shí)現(xiàn)輔酶的再生。對誘導(dǎo)條件進(jìn)行了優(yōu)化,最佳誘導(dǎo)條件組合為:菌體濃度OD_(600)=0.5,誘導(dǎo)劑濃度0.4 mmol·L~(-1),誘導(dǎo)溫度20℃,誘導(dǎo)時(shí)長25 h。(4)對全細(xì)胞轉(zhuǎn)化條件進(jìn)行了優(yōu)化,最佳轉(zhuǎn)化條件為:轉(zhuǎn)化溫度25℃,轉(zhuǎn)化體系pH=6.5,菌體濕重為20 g·L~(-1),3,4-二羥基苯丙酮酸濃度為70 mmol·L~(-1)。最終,L-丹參素的產(chǎn)量達(dá)到15.91 g·L~(-1)。
【圖文】：

究人員就對其化學(xué)組分進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)它主要由兩類化合物家族烯奎寧化合物（如丹參酮、隱丹參酮、異噻嗪酮等）和親水性的多、丹酚酸 B、原兒茶醛等）[1]。丹參作為東方醫(yī)學(xué)上的傳統(tǒng)中藥，距最先記載于秦漢時(shí)期《神農(nóng)本草經(jīng)》，后于明朝時(shí)期在《本草綱目》正式收錄在《中國藥典》中，傳承至現(xiàn)在[2]。（Danshensu，簡稱 DSS）是從丹參中發(fā)現(xiàn)的水溶性酚類羧酸化合物基苯乳酸（3,4-dihydroxyphenyllactic acid）。它的化學(xué)結(jié)構(gòu)中含有兒茶穩(wěn)定，，導(dǎo)致丹參素的化學(xué)性質(zhì)極不穩(wěn)定，在堿性和高溫條件下易聚通常將其制成鈉鹽（丹參素鈉），貯藏于陰涼干燥處。丹參素存在兩 D-DSS 與其對映異構(gòu)體 L-DSS，結(jié)構(gòu)式如圖 1-1 所示。我們與西北合作，進(jìn)行了丹參素的相關(guān)研究，發(fā)現(xiàn) L-丹參素和 D-丹參素具有類-丹參素，L-丹參素的藥理活性更加顯著，這一結(jié)論也正好在前人[3, 驗(yàn)證。除此之外，L-丹參素還能作為合成多種多酚酸類化合物的前 E. Bogucki 等人[5]利用 L-丹參素、咖啡酸等前體物質(zhì)，經(jīng)一系列化學(xué)香酸。

江南大學(xué)碩士學(xué)位論文學(xué)性質(zhì)研究，為酶法生產(chǎn) L-丹參素奠定了理論和技術(shù)基礎(chǔ)。L基苯丙酮酸轉(zhuǎn)化為 L-丹參素的反應(yīng)需要輔酶 NADH 或 NADPH ADPH 比較昂貴，在酶催化反應(yīng)過程中僅靠外源添加會(huì)增加生產(chǎn)枯草芽孢桿菌的葡萄糖脫氫酶和 L-乳酸脫氫酶在大腸桿菌中進(jìn)丙酮酸和葡萄糖為底物，全細(xì)胞生產(chǎn) L-丹參素，實(shí)現(xiàn)輔酶 NAD利用，此外，細(xì)胞自身產(chǎn)生的輔酶也能被全細(xì)胞反應(yīng)體系充分菌全細(xì)胞催化體系的誘導(dǎo)條件和全細(xì)胞催化條件進(jìn)行優(yōu)化，成高光學(xué)純度的 L-丹參素的生產(chǎn)工藝路線，為 L-丹參素的工業(yè)化及參考價(jià)值。用重組大腸桿菌全細(xì)胞生產(chǎn) L-丹參素的示意圖如圖 1-2 所示：
【學(xué)位授予單位】：江南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：TS201.3

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 孫政敏;賈昭華;;某干式生化分析儀的使用評(píng)價(jià)[J];國際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志;2011年19期

2 陳敬捷;李勇;何晗;蘇凌松;秦松樹;胡宏波;唐秀文;;AIDS合并PCP患者血清LDH檢測的診斷意義及療效觀察[J];國際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志;2012年10期

3 王磊;周培培;顏學(xué)兵;徐娟;趙力;孟雷;;危重癥甲型H1N1流感患者生化指標(biāo)總結(jié)分析[J];中華臨床醫(yī)師雜志(電子版);2010年11期

4 郭健蓮;張陽根;徐忠玉;李強(qiáng);;顱腦疾病患者血清及腦脊液中心肌酶譜檢測的意義[J];國際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志;2010年05期

5 王惠萱;吳樂斌;賈雄飛;唐建國;滕毅;周潔;佘文婕;朱光旭;;不同試劑檢測血清LDH結(jié)果的可比性及偏倚評(píng)估研究[J];國際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志;2010年10期

6 馬慧霞;郭淑麗;龐秀慧;范淑英;;多發(fā)性骨髓瘤患者血清乳酸脫氫酶、α-羥丁酸脫氫酶、超敏C反應(yīng)蛋白的變化及臨床意義[J];國際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志;2011年14期

7 陳紅濤;張紅雨;舒小春;張麗娟;李克學(xué);劉偉;;肺癌患者血清CRP、LDH、CEA聯(lián)合檢測的臨床意義[J];國際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志;2009年09期

8 劉馮;肖丁華;莫東華;劉智屏;文飛球;;血清乳酸脫氫酶在兒童急性溶血性貧血診治中的臨床意義[J];中國全科醫(yī)學(xué);2011年05期

9 顧敏;蔣最明;劉佳強(qiáng);劉昌盛;;聯(lián)合檢測ADA、LDH和TB-Ab在鑒別診斷胸腔積液中的價(jià)值[J];國際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志;2009年07期

10 趙昕;于宏穎;全南虎;鄭楊;;磷脂酰肌醇3激酶信號(hào)通路在缺血后適應(yīng)中對大鼠心肌保護(hù)機(jī)制的研究[J];中華老年心腦血管病雜志;2010年01期

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前4條

1 盧歡;發(fā)酵乳桿菌L-乳酸脫氫酶的篩選鑒定及其在L-丹參素合成中的應(yīng)用[D];江南大學(xué);2019年

2 呂敏;假單胞菌中乙偶姻代謝途徑及新型L-乳酸脫氫酶研究[D];山東大學(xué);2015年

3 王曉珊;瘦素在大鼠心肌缺血—再灌注損傷中作用的研究[D];桂林醫(yī)學(xué)院;2011年

4 王穎;重組大腸桿菌全細(xì)胞合成光學(xué)純L-苯基乳酸[D];吉林農(nóng)業(yè)大學(xué);2016年

本文編號(hào)：2650385