【摘要】：類胡蘿卜素及其衍生物不僅是許多抗逆物質(zhì)生物合成的前體物,而且還調(diào)控植物花色、香氣風(fēng)味等,廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、衛(wèi)生、食品、保健等行業(yè)。類胡蘿卜素的裂解受類胡蘿卜素裂解雙加氧酶(carotenoid cleavage dioxygenase,CCDs)調(diào)控。CCDs是植物體內(nèi)類胡蘿卜素裂解代謝途徑中的關(guān)鍵酶,含有9個成員,其中CCD1的調(diào)控機制最為復(fù)雜。為了深入研究桂花OfCCD1基因在香氣生物合成中的生理功能,本研究采用RACE-PCR技術(shù)克隆桂花的OfCCD1基因,并進行核酸序列、蛋白質(zhì)序列的分析,了解其結(jié)構(gòu)特點;利用半定量PCR方法研究OfCCD1基因表達模式與含量變化,明確其表達規(guī)律;采用原核表達的方法進行誘導(dǎo)、純化CCD1蛋白質(zhì),鑒定其氧化酶活性;利用葉盤法轉(zhuǎn)化法和花序浸染法轉(zhuǎn)化煙草和擬南芥,揭示其生理功能,取得如下實驗結(jié)果:1、核酸序列分析結(jié)果表明,桂花OfCCD1基因的完整開放讀碼框(ORF)長度為1632 bp,編碼的蛋白質(zhì)序列含有543個氨基酸,分子式為C2785H4294N7200791S24,相對分子質(zhì)量約為61288.52,理論等電點為6.27,脂溶指數(shù)80.77,總平均疏水指數(shù)為-0.262。其二級結(jié)構(gòu)主要由α-螺旋(11.60%)、無規(guī)則卷曲(58.38%)、延伸鏈(23.76%)和β-轉(zhuǎn)角(6.26%)組成,其蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)與玉米中的同源蛋白質(zhì)VP14相似度最高;2、金桂、銀桂、丹桂和四季桂OfCCD1基因均在香眼期時表達水平最低,依次在盛花初期、盛花中期、盛花中期和盛花初期時達到峰值,表明OfCCD1基因的表達豐度因桂花種類的不同而存在差異性表達,且具有時空特異性;3、0.5 M濃度的IPTG可以誘導(dǎo)OfCCD1蛋白的表達,通過鎳柱純化可以得到目的蛋白,分子量約為64KDa;同時利用His抗體進行鑒定,可以觀察到目的條帶,大小與目的蛋白相符合;4、采用葉盤法轉(zhuǎn)化煙草植株,通過抗性篩選獲得了抗性轉(zhuǎn)基因植株,同時利用半定量PCR進行檢測,可以擴增到OfCCD1基因;采用花序浸染法轉(zhuǎn)化擬南芥植株(Col-0),獲得了 OfCCD1過表達的陽性植株,為進一步研究OfCCD1的生理功能奠定了基礎(chǔ)。
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２．２結(jié)果與分析逡逑２．２．１桂花總ＲＮＡ的提取逡逑提取桂花花瓣總ＲＮＡ，１．５％瓊脂糖凝膠電泳檢測。結(jié)果表明（圖３），逡逑２８Ｓ邋ｒＲＮＡ及１８Ｓ邋ｒＲＮＡ條帶清晰，無降解，說明提取的ＲＮＡ可以用于之逡逑后的反轉(zhuǎn)錄和ＰＣＲ實驗。逡逑１１逡逑

又非常有特色，在超氧化物還原酶、富馬酸還原酶中常見。它由七葉片＾逡逑螺旋槳組成，螺旋槳軸上的四個組氨酸，，可以固定Ｆｅ２＋離子，從而標(biāo)記逡逑酶活性中心（圖８邋）。逡逑：S�，辶x賢跡稿澹埃茫茫模鋇鞍酌富钚災(zāi)行膩義希疲椋紓福澹牛睿恚邋澹粒悖簦椋觶椋簦澹茫澹睿簦澹蟈澹錚駑澹希媯茫茫模戾義希保跺義

本文編號：2634602