【摘要】：青藏高原平均海拔4000米,世代棲息在這片高原的小哺乳動(dòng)物面臨著低氧而寒冷的氣候挑戰(zhàn),在長(zhǎng)期繁衍和適應(yīng)進(jìn)化中,這些動(dòng)物形成了特別的環(huán)境適應(yīng)機(jī)制,為我們研究環(huán)境適應(yīng)性提供了天然的研究對(duì)象。高原鼢鼠(Myospalax baileyi)世居青藏高原高寒草甸(海拔3800-4500米),常年?duì)I地下生活,生境具有低氧、寒冷和高CO2的特點(diǎn)。甘肅鼢鼠(Myospalax cansus)分布于陜甘地區(qū)的黃土高原(海拔800-1500米),同樣營(yíng)地下生活,經(jīng)受低氧和高CO2的脅迫。鼠科雙微體MDM2(Murine double minute 2)和 MDMX(Murine double minute X)是 MDM 家族中重要的原癌基因,也是p53的主要負(fù)調(diào)控分子。正常生理情況下,MDM2介導(dǎo)p53蛋白的泛素化降解,而MDMX是這個(gè)過(guò)程的關(guān)鍵輔助因子,二者共同抑制p53,使其蛋白維持低水平表達(dá);MDMX除了輔助p53泛素化降解,還可以通過(guò)結(jié)合p53 DBD結(jié)構(gòu)域,抑制p53對(duì)靶基因的轉(zhuǎn)錄活性。當(dāng)機(jī)體面對(duì)DNA損傷應(yīng)激時(shí),MDM2/X促進(jìn)p53蛋白的積累,并幫助p53 mRNA轉(zhuǎn)錄和翻譯。最新研究發(fā)現(xiàn),在腫瘤低氧微環(huán)境中,HIF-2α通過(guò)減少活性氧簇(ROS)的積累,促進(jìn)AKT介導(dǎo)的MDM2磷酸化,抑制p53的蛋白表達(dá)與轉(zhuǎn)錄活性。因此p53,MDM2/X和HIF-2α之間存在復(fù)雜的互作。實(shí)驗(yàn)室以往研究發(fā)現(xiàn),高原鼢鼠和根田鼠p53編碼區(qū)的變異會(huì)影響細(xì)胞凋亡的適應(yīng)性改變;而在以色列相鄰但不同土壤微環(huán)境的兩類(lèi)盲鼴鼠中,p53啟動(dòng)子區(qū)的甲基化水平差異影響p53對(duì)靶基因的轉(zhuǎn)錄和細(xì)胞命運(yùn)的改變,這種適應(yīng)性的改變貢獻(xiàn)給同域物種的形成。本研究中以高原鼢鼠和甘肅鼢鼠為主要研究對(duì)象,運(yùn)用分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)和生物信息學(xué)技術(shù)探討MDM2/MDMX-HIF-2α-p53分子間相互作用在高原低氧環(huán)境適應(yīng)中的潛在機(jī)制,獲得如下結(jié)果:1、克隆了高原鼢鼠,甘肅鼢鼠,根田鼠和北美草原田鼠的MDMX編碼區(qū)序列,高原鼢鼠和甘肅鼢鼠的MDM2啟動(dòng)子區(qū)序列以及甘肅鼢鼠HIF-2α編碼區(qū)序列,并與人類(lèi)、大鼠、小鼠和以色列盲鼴鼠等動(dòng)物進(jìn)行了基因比對(duì)分析,發(fā)現(xiàn)高原鼢鼠與甘肅鼢鼠的MDMX和HIF-2α氨基酸序列同源性極高,分別為99.60%和97.59%,與別的動(dòng)物相比同源性為85%左右,高原鼢鼠和甘肅鼢鼠有共同的氨基酸變異位點(diǎn),可能涉及磷酸化、乙酰化水平的改變。2、克隆了高原鼢鼠和甘肅鼢鼠肺臟MDM2啟動(dòng)子區(qū)序列,并利用生物信息學(xué)技術(shù)預(yù)測(cè)MDM2啟動(dòng)子區(qū)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn),高原鼢鼠和甘肅鼢鼠共有17種相同的轉(zhuǎn)錄因子。對(duì)MDM2啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平進(jìn)行檢測(cè),發(fā)現(xiàn)兩種動(dòng)物啟動(dòng)子區(qū)CpG島分布位置相似,但整體甲基化水平有顯著差異,大部分CG位點(diǎn)甲基化水平差異顯著,共分析統(tǒng)計(jì)出10個(gè)差異顯著的CG位點(diǎn)位于MDM2啟動(dòng)子區(qū)-166bp～-81 bp 之間。3、高原鼢鼠,甘肅鼢鼠肺、脾、肝組織中的MDM2、p53和Cited基因表達(dá)水平均顯著高于平原實(shí)驗(yàn)室SD大鼠,脾組織中HIF-2α和VEGFR-2的基因表達(dá)顯著高于SD大鼠,肝組織中HIF-2α基因表達(dá)也顯著高于SD大鼠,但MDMX基因表達(dá)在三種組織均與SD大鼠無(wú)顯著差異。SD大鼠暴露于不同時(shí)間、強(qiáng)度的低氧后,肺組織中p53表達(dá)顯著下降,脾組織中HIF-2α和VEGFR-2顯著上升,肝組織中p53表達(dá)顯著下降。8%02低氧下,脾組織中MDM2、p53、HIF-2α、CITED和VEGFR-2基因表達(dá)均顯著上升,肝組織中Cited基因表達(dá)顯著上升,MDMX、p53和VEGFR-2基因表達(dá)顯著下降。4、高原鼢鼠HIF-2α的S480變異貢獻(xiàn)給HIF-2α轉(zhuǎn)錄活性的升高。常氧和低氧情況下,S480和A480組較T480組(人和大、小鼠相同)HIF-2α的低氧反應(yīng)元件結(jié)合能力均顯著上升。但在低氧后,S480和A480組的HIF-2α低氧反應(yīng)元件結(jié)合能力均顯著降低。S189變異在常氧和低氧下都對(duì)HIF-2α結(jié)合低氧反應(yīng)元件影響不顯著,在低氧后與低氧反應(yīng)元件結(jié)合能力顯著降低。5、高原鼢鼠、甘肅鼢鼠和SD大鼠的MDM2+p53、MDMX+p53、MDM2/X+p53共轉(zhuǎn)入H1299或HEK-293T細(xì)胞。常氧下,高原鼢鼠MDM2/X不影響p53參與的細(xì)胞凋亡,而甘肅鼢鼠和大鼠MDM2/X共同導(dǎo)致了細(xì)胞凋亡的增加。低氧應(yīng)激后細(xì)胞凋亡率均顯著降低,高原鼢鼠MDM2/X顯著抑制p53介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡,而甘肅鼢鼠和大鼠MDM2和MDMX抑制凋亡無(wú)明顯差異。在低氧應(yīng)激的細(xì)胞凋亡下調(diào)過(guò)程中,p53發(fā)揮著重要作用。6、高原鼢鼠HIF-2α 480位點(diǎn)變異對(duì)細(xì)胞凋亡影響不顯著。高原鼢鼠HIF-2α變異體(S480、T480和A480)和p53共轉(zhuǎn)染后,低氧下均顯著降低細(xì)胞的凋亡率。結(jié)果提示,高原鼢鼠和甘肅鼢鼠MDM2,MDMX和p53分子的自然變異演化貢獻(xiàn)給高原環(huán)境適應(yīng)性調(diào)節(jié),在低氧下MDM2和MDMX促進(jìn)p53的抗凋亡作用是高原鼢鼠適應(yīng)特殊低下環(huán)境的策略,而其HIF-2α的480位點(diǎn)變異上調(diào)了對(duì)靶基因轉(zhuǎn)錄活性,可能貢獻(xiàn)給高原鼢鼠地下極端環(huán)境的適應(yīng)性。
【圖文】：

、、ＭＤＭＸ基因ＣＤＳ區(qū)序列克隆逡逑ａｎｋ數(shù)據(jù)庫(kù)中大鼠ＭＤＭＸ序列（ＮＭ＿００１０１２０２６）設(shè)計(jì)序列克隆分為５段進(jìn)行，，分別為Ｐ１：１￣５０９，Ｐ２：１８？７１４，Ｐ５：１２０１￣１６０１邋（ＣＤＳ區(qū)為２７？１４９９）；以高原鼢鼠脾臟擴(kuò)增結(jié)果用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行片段大小檢測(cè)，結(jié)果０９匕？、６９７＆口、４０８匕？、６２８匕口和４９（＾？，與預(yù)期的結(jié)果果相同）。測(cè)序結(jié)果返回，與大鼠序列進(jìn)行比對(duì)分析，ｍＲＮＡ序列，包含完整的ＣＤＳ區(qū)序列，全長(zhǎng)為１６０１邋的ＭＤＭＸ蛋白（Ｆｉｇ邋３．１Ｂ）。克隆成功的ＭＤＭＸ序列已號(hào)為ＭＨ０３３６２６。逡逑

１５６１邐ａａａａａｔｃａｇａｇｇｔａｇａａｇｇａｔｃａｃｃａａｔｔｔｔｇａｔｇ逡逑圖３．２Ｂ甘肅鼢鼠ＭＤＭＸ編碼區(qū)堿基和氨基酸序列（編碼區(qū)已用下劃線(xiàn)標(biāo)記出）逡逑Ｆｉｇ邋３．２Ｂ邋Ｔｈｅ邋ＭＤＭＸ邋ＣＤＳ邋ｒｅ
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：Q953

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本文編號(hào)：2611560