銀杏黃酮合成途徑GbDFR家族三個新基因的克隆與功能研究

發(fā)布時間：2020-04-01 12:52

【摘要】：二氫黃酮醇4-還原酶(dihydroflavonol 4-reductase,DFR)是參與植物黃酮合成途徑下游花青素合成的關鍵酶。DFR不僅影響植物花和果實的顏色,而且對于植物不同黃酮組分的分配具有一定的調控作用。銀杏作為最古老的孑遺植物,具有極高的營養(yǎng)價值和藥用價值,尤其對心腦血管疾病的防治有顯著的療效。黃酮類物質是銀杏提取物的主要活性成分之一,所以研究銀杏黃酮合成途徑具有重要的現(xiàn)實意義。本研究以擬南芥At DFR基因為參考,對銀杏全基因組序列進行比對,發(fā)現(xiàn)了銀杏Gb DFR家族的三個新基因并對這三個新基因的功能和特性進行了比較系統(tǒng)的研究。我們首先考查了外源激素和環(huán)境刺激對銀杏黃酮合成及這三個基因表達的影響,初步分析了三個基因在外界刺激誘發(fā)銀杏黃酮合成過程中的功能差異;然后分別構建了這三個基因的表達載體,通過注射煙草和擬南芥tt3突變體瞬時表達后的蛋白體外酶活實驗初步驗證這三個基因的功能;最后通過轉化野生型煙草及擬南芥tt3突變體對這三個基因的功能進行進一步的驗證。主要研究內容及結果如下:1、根據擬南芥的At DFR基因序列,利用生物信息學技術對銀杏全基因組序列進行搜索比對,獲得銀杏三個基因的序列。通過序列比對分析,我們發(fā)現(xiàn)這三個基因與之前報道的三個Gb DFR基因不同,所以將它們分別命名為Gb DFR4、Gb DFR5和Gb DFR6。2、考察了外源施加水楊酸(SA)和茉莉酸(JA)以及季節(jié)變化對銀杏黃酮含量以及三個基因表達的影響。結果顯示:SA和JA處理都能影響銀杏黃酮的含量,不過它們對三個Gb DFR基因的調控比較復雜。另外,從四月份開始,銀杏的花青素含量逐月上升,但是三個Gb DFR基因的表達量卻逐月下降。3、克隆了這三個Gb DFR基因,構建了它們的35S超表達載體。4、通過注射煙草和擬南芥tt3突變體的葉片對Gb DFR蛋白進行瞬時表達,并對提取的蛋白進行體外酶活實驗分析。結果顯示,三個基因編碼的蛋白在體外都具有DFR的酶活性。5、用葉盤法將三個Gb DFR基因的表達載體分別轉入野生型煙草中,考察外源基因的表達對煙草花色及花青素含量的影響。結果顯示,轉基因煙草的花青素含量比野生型更高,花的顏色更深。6、通過花序侵染法將三個Gb DFR基因轉化擬南芥tt3突變體進行功能回復實驗,在剛剛獲得的轉基因陽性苗中觀察到了多個生長點,推測與生長素運輸有關。綜上所述,本論文實驗結果初步證明這三個基因能夠行使DFR基因的功能,具有二氫黃酮醇4-還原酶活性。
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花青素苷,催化合成,還原酶

圖 1.1 二氫黃酮醇 4-還原酶催化合成花青素苷Figure 1.1 Anthocyanins catalytic synthesis by dihydroflavonol 4-reducta當前經濟全球化的發(fā)展趨勢，人們的飲食文化也日漸多樣化簡單的溫飽等生理的基本需求，而是追求更高的精神上的味費者需求，各種食品加工方式花樣百出，由此而來的各種安球關注的焦點�；ㄇ嗨匾蚱洫毺氐目寡趸�，且作為一種安著色劑，在社會中廣泛利用，，需求日益增大。近年來花青素夠促進健康的特性和生態(tài)意義引起了廣大植物學家的極大興獲得了諸多研究成果，但仍然無法滿足巨大的市場需求，因存在無限的發(fā)展?jié)摿56]。 DFR 基因的特征及功能研究物 DFR 基因的結構特征

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