大腸桿菌O157:H7(Escherichia coli O157:H7)是一種重要的食源性致病菌,感染人類后會(huì)引起發(fā)熱、惡心、嘔吐、腹部絞痛和腹瀉等癥狀,嚴(yán)重時(shí)甚至?xí)䦟?dǎo)致出血性腹瀉或溶血性尿毒綜合征。根據(jù)世界衛(wèi)生組織的研究報(bào)道,人們因食用被E.coli O157:H7污染的肉制品、奶制品以及果蔬制品等食物而導(dǎo)致多次疫情爆發(fā),因此建立準(zhǔn)確有效的檢測(cè)方法對(duì)于監(jiān)控和預(yù)防E.coli O157:H7引起的食物中毒具有重要意義。雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Hybridization chain reaction,HCR)是一種核酸等溫信號(hào)放大技術(shù),通過目標(biāo)鏈與兩條發(fā)夾探針交替雜交,在無需酶催化作用下,實(shí)現(xiàn)核酸信號(hào)放大。HCR因其操作簡便、設(shè)計(jì)靈活,并且可以結(jié)合不同的信號(hào)輸出策略而被廣泛應(yīng)用。本研究基于HCR核酸信號(hào)放大技術(shù),結(jié)合新型阻斷(blocker)引物建立了牛奶中E.coli O157:H7的檢測(cè)方法,各章內(nèi)容分述如下:第一章綜述了雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)介導(dǎo)的信號(hào)輸出策略在檢測(cè)領(lǐng)域中應(yīng)用的研究進(jìn)展。第二章建立了 PCR-HCR雙信號(hào)放大策略用于牛奶中E.coli O157:H7的檢測(cè)。該方法以E.coli O1...

【文章頁數(shù)】：85 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
第1章 引言
    1.1 前言
    1.2 HCR原理
    1.3 HCR種類
    1.4 HCR介導(dǎo)的信號(hào)輸出策略
        1.4.1 比色法
        1.4.2 熒光法
        1.4.3 電化學(xué)法
        1.4.4 化學(xué)發(fā)光法
    1.5 HCR檢測(cè)的應(yīng)用
        1.5.1 核酸檢測(cè)
        1.5.2 細(xì)菌檢測(cè)
        1.5.3 其他生物分子的檢測(cè)
    1.6 HCR存在的不足及發(fā)展趨勢(shì)
    1.7 研究的目的與意義
    1.8 研究的內(nèi)容
第2章 PCR-HCR雙信號(hào)放大方法檢測(cè)E.coli O157:H7的研究
    2.1 前言
    2.2 材料與儀器
        2.2.1 實(shí)驗(yàn)菌株
        2.2.2 主要的實(shí)驗(yàn)試劑
        2.2.3 主要的實(shí)驗(yàn)儀器及設(shè)備
        2.2.4 實(shí)驗(yàn)相關(guān)試劑的配置方法
    2.3 實(shí)驗(yàn)方法
        2.3.1 引物和發(fā)夾探針設(shè)計(jì)
        2.3.2 菌株活化及培養(yǎng)
            2.3.2.1 菌株活化
            2.3.2.1 菌株計(jì)數(shù)
        2.3.3 DNA提取
        2.3.4 PCR擴(kuò)增及電泳表征
        2.3.5 主要反應(yīng)條件的優(yōu)化
            2.3.5.1 修飾引物濃度的優(yōu)化
            2.3.5.2 SA-MBs孵育時(shí)間的優(yōu)化
            2.3.5.3 SA-MBs反應(yīng)濃度的優(yōu)化
            2.3.5.4 發(fā)夾探針濃度的優(yōu)化
            2.3.5.5 HCR反應(yīng)時(shí)間的優(yōu)化
        2.3.6 PCR信號(hào)放大方法在純菌液中的靈敏度
        2.3.7 PCR-HCR雙信號(hào)放大方法在純菌液中的靈敏度
        2.3.8 PCR-HCR雙信號(hào)放大方法的特異性
        2.3.9 PCR-HCR雙信號(hào)放大方法在牛奶加標(biāo)樣中的靈敏度
        2.3.10 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析
    2.4 結(jié)果與討論
        2.4.1 PCR-HCR雙信號(hào)放大方法的原理
        2.4.2 發(fā)夾探針的設(shè)計(jì)
        2.4.3 PCR-HCR雙信號(hào)放大方法可行性驗(yàn)證
            2.4.3.1 電泳驗(yàn)證修飾引物和發(fā)夾探針
            2.4.3.2 熒光驗(yàn)證PCR-HCR雙信號(hào)放大
            2.4.3.3 共聚焦成像驗(yàn)證
        2.4.4 實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化
            2.4.4.1 修飾引物濃度的優(yōu)化
            2.4.4.2 SA-MBs孵育時(shí)間的優(yōu)化
            2.4.4.3 SA-MBs濃度的優(yōu)化
            2.4.4.4 發(fā)夾探針濃度的優(yōu)化
            2.4.4.5 HCR反應(yīng)時(shí)間的優(yōu)化
        2.4.5 PCR信號(hào)放大方法在純菌液中LOD的確定
        2.4.6 PCR-HCR雙信號(hào)放大方法在純菌液中LOD的確定
        2.4.7 PCR-HCR雙信號(hào)放大方法特異性評(píng)價(jià)
        2.4.8 PCR-HCR雙信號(hào)放大方法在牛奶加標(biāo)樣中LOD的確定
    2.5 小結(jié)
第3章 HCR結(jié)合聚多巴胺檢測(cè)E. coli O157:H7的研究
    3.1 前言
    3.2 材料與儀器
        3.2.1 實(shí)驗(yàn)菌株
        3.2.2 主要的實(shí)驗(yàn)試劑
        3.2.3 主要的實(shí)驗(yàn)儀器及設(shè)備
        3.2.4 實(shí)驗(yàn)相關(guān)試劑的配置方法
    3.3 實(shí)驗(yàn)方法
        3.3.1 引物和發(fā)夾探針設(shè)計(jì)
        3.3.2 PCR擴(kuò)增及電泳表征
        3.3.3 PDA的制備
        3.3.4 PDA性能評(píng)價(jià)
        3.3.5 金屬鹽離子對(duì)PDA吸附效果的影響
        3.3.6 反應(yīng)條件的優(yōu)化
            3.3.6.1 HCR反應(yīng)時(shí)間的優(yōu)化
            3.3.6.2 反應(yīng)緩沖液pH的優(yōu)化
            3.3.6.3 PDA孵育時(shí)間的優(yōu)化
            3.3.6.4 PDA反應(yīng)濃度的優(yōu)化
        3.3.7 HCR結(jié)合PDA在純菌液中的靈敏度
        3.3.8 HCR結(jié)合PDA檢測(cè)E. coli O157:H7的特異性
        3.3.9 HCR結(jié)合PDA在牛奶加標(biāo)樣中的靈敏度
        3.3.10 數(shù)據(jù)分析
    3.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        3.4.1 HCR結(jié)合PDA檢測(cè)E.coli O157:H7的原理
        3.4.2 發(fā)夾探針的設(shè)計(jì)
        3.4.3 PDA的表征
        3.4.4 PDA抗干擾效果
        3.4.5 金屬鹽對(duì)PDA吸附效果的影響
        3.4.6 HCR結(jié)合PDA方法可行性驗(yàn)證
            3.4.6.1 電泳驗(yàn)證引物和發(fā)夾探針
            3.4.6.2 HCR結(jié)合PDA方法的熒光驗(yàn)證
        3.4.7 實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化
            3.4.7.1 HCR反應(yīng)時(shí)間的優(yōu)化
            3.4.7.2 反應(yīng)緩沖液pH的優(yōu)化
            3.4.7.3 PDA孵育時(shí)間的優(yōu)化
            3.4.7.4 PDA反應(yīng)濃度的優(yōu)化
        3.4.8 HCR結(jié)合PDA在純菌液中LOD的確定
        3.4.9 HCR結(jié)合PDA的特異性評(píng)價(jià)
        3.4.10 HCR結(jié)合PDA在牛奶加標(biāo)樣中LOD的確定
    3.5 小結(jié)
第4章 結(jié)論與展望
    4.1 結(jié)論
        4.1.1 PCR-HCR雙信號(hào)放大方法較傳統(tǒng)方法可以提高E.coli O57:H7的檢測(cè)靈敏度
        4.1.2 HCR結(jié)合PDA可實(shí)現(xiàn)均相體系下E.coli O157:H7的檢測(cè)
    4.2 展望
致謝
參考文獻(xiàn)
附錄A 實(shí)驗(yàn)試劑和材料
附錄B 實(shí)驗(yàn)儀器及設(shè)備
個(gè)人簡介
獲獎(jiǎng)情況
攻讀學(xué)位期間的研究成果



本文編號(hào)：3878021