為應(yīng)對食品安全、飲用水污染及病原體感染等全球公共衛(wèi)生事件,開發(fā)具有高靈敏、高準(zhǔn)確性的快速檢測方法,對于有效控制全球公共衛(wèi)生風(fēng)險具有重要的現(xiàn)實意義。基于辣根過氧化物酶(HRP)催化3,3’,5,5’-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)顯色的ELISA方法因具有特異性好,檢測通量高,價格便宜等優(yōu)勢,已成為食品安全相關(guān)污染物快速、高通量篩選的首選方案。然而,傳統(tǒng)以HRP催化TMB顯色的快檢方法,存在酶催化產(chǎn)物顏色單一、產(chǎn)物信號強(qiáng)度不高(TMB摩爾消光系數(shù)3.9×10⁴ M^-1 cm^-1)、檢測靈敏度偏低、無法實現(xiàn)裸眼檢測等缺陷;此外,傳統(tǒng)ELISA的免疫學(xué)反應(yīng)大多基于半固相界面,存在反應(yīng)效率不高、需要反復(fù)加樣及洗板等操作過程,檢測步驟相對繁瑣。因此,如何提高快檢方法的檢測靈敏度,構(gòu)建適合現(xiàn)場使用的新策略,成為當(dāng)前亟需解決的問題。本研究擬以有機(jī)小分子化合物黃曲霉毒素(AFB₁)、三磷酸腺苷(ATP)及無機(jī)鈉離子(Na⁺)等為模式分析物,從提升樣本前處理效率,優(yōu)化信號輸出靈敏度及構(gòu)建均相快檢體系的角...

【文章頁數(shù)】：139 頁

【學(xué)位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
縮略語(Abbreviations)
第1章 引言
    1.1 快速檢測技術(shù)
        1.1.1 快速檢測技術(shù)概述
        1.1.2 快速檢測技術(shù)工作流程
    1.2 生物識別元件
        1.2.1 生物識別元件概述
        1.2.2 抗體及其在快速檢測方法中的應(yīng)用
        1.2.3 功能核酸及其在快速檢測方法中的應(yīng)用
        1.2.4 分子印記聚合物及其在快速檢測方法中的應(yīng)用
    1.3 酶介導(dǎo)信號傳輸
        1.3.1 酶概述
        1.3.2 酶介導(dǎo)的電化學(xué)分析方法及其應(yīng)用
        1.3.3 酶介導(dǎo)的等離子共振分析方法及其應(yīng)用
        1.3.4 酶介導(dǎo)的化學(xué)發(fā)光分析方法及其應(yīng)用
        1.3.5 酶介導(dǎo)的熒光分析方法及其應(yīng)用
        1.3.6 酶介導(dǎo)的pH響應(yīng)分析方法及其應(yīng)用
        1.3.7 酶介導(dǎo)的分析方法發(fā)展方向
    1.4 CRISPR/Cas介導(dǎo)的分析方法研究進(jìn)展
        1.4.1 CRISPR/Cas概述
        1.4.2 CRISPR/Cas9介導(dǎo)的分析檢測方法及其研究進(jìn)展
        1.4.3 CRISPR/Cas12a介導(dǎo)的分析檢測方法及其研究進(jìn)展
        1.4.4 CRISPR/Cas13a介導(dǎo)的分析檢測方法及其研究進(jìn)展
    1.5 黃曲霉毒素及其檢測方法研究進(jìn)展
        1.5.1 黃曲霉毒素簡介
        1.5.2 黃曲霉毒素的污染現(xiàn)狀
        1.5.3 黃曲霉毒素污染樣品前處理方法
        1.5.4 AFB₁檢測方法研究進(jìn)展
    1.6 三磷酸腺苷及其檢測方法研究進(jìn)展
    1.7 Na⁺及其檢測方法研究進(jìn)展
    1.8 研究內(nèi)容與意義
        1.8.1 研究內(nèi)容
        1.8.2 研究意義
第2章 基于MB@PAA@Nb的磁性免疫親和提取方法研究
    2.1 主要試劑材料與儀器設(shè)備
        2.1.1 試劑材料
        2.1.2 儀器設(shè)備
    2.2 實驗方法及步驟
        2.2.1 MB@PAA的合成與表征
        2.2.2 Anti-AFB₁ Nb的表達(dá)和純化
        2.2.3 MB@PAA@Nb的制備及其吸附模型評價
        2.2.4 MB@PAA@Nb性能評價
    2.3 結(jié)果與討論
        2.3.1 Anti-AFB₁ Nb的表達(dá)
        2.3.2 MB@PAA的表征
        2.3.3 MB@PAA@Nb的制備
        2.3.4 MB@PAA@Nb吸附AFB1的等溫吸附曲線建立
        2.3.5 MB@PAA@Nb性能評價
    2.4 本章小結(jié)
第3章 基于GOx介導(dǎo)pH響應(yīng)ELISA高靈敏檢測AFB1的方法學(xué)研究
    3.1 主要試劑材料與儀器設(shè)備
        3.1.1 試劑材料
        3.1.2 儀器設(shè)備
    3.2 實驗方法與步驟
        3.2.1 GOx-AFB₁全抗原的制備
        3.2.2 BCPpH突變點的確定
        3.2.3 GOx介導(dǎo)pH響應(yīng)ELISA的建立
        3.2.4 樣品制備
        3.2.5 實驗參數(shù)優(yōu)化
        3.2.6 pH響應(yīng)ELISA性能評價
    3.3 結(jié)果與討論
        3.3.1 BCPpH突變點確定
        3.3.2 GOx-AFB1的表征
        3.3.3 免疫反應(yīng)及酶催化反應(yīng)條件優(yōu)化
        3.3.4 pH響應(yīng)ELISA性能評價
    3.4 本章小結(jié)
第4章 基于GOx介導(dǎo)等離子共振ELISA高靈敏檢測AFB₁的方法學(xué)研究
    4.1 主要試劑材料與儀器設(shè)備
        4.1.1 試劑材料
        4.1.2 儀器設(shè)備
    4.2 實驗方法與步驟
        4.2.1 AuNR的合成
        4.2.2 AuNR刻蝕條件優(yōu)化
        4.2.3 GOx介導(dǎo)等離子共振ELISA的建立
        4.2.4 等離子共振ELISA性能評價
    4.3 結(jié)果與討論
        4.3.1 AuNR的表征及GOx介導(dǎo)AuNR刻蝕可行性
        4.3.2 AuNR刻蝕條件優(yōu)化
        4.3.3 免疫反應(yīng)條件及酶催化條件優(yōu)化
        4.3.4 等離子共振ELISA性能評價
    4.4 本章小結(jié)
第5章 基于GOx介導(dǎo)熒光ELISA超靈敏檢測AFB₁的方法學(xué)研究
    5.1 主要試劑材料與儀器設(shè)備
        5.1.1 試劑材料
        5.1.2 儀器設(shè)備
    5.2 實驗方法與步驟
        5.2.1 CuNP的合成
        5.2.2 CuNP合成參數(shù)優(yōu)化
        5.2.3 GOx介導(dǎo)熒光ELISA的建立
        5.2.4 熒光ELISA的性能評價
    5.3 實驗結(jié)果與討論
        5.3.1 CuNP合成條件優(yōu)化及表征
        5.3.2 GOx介導(dǎo)CuNP合成可行性
        5.3.3 GOx介導(dǎo)熒光ELISA的建立和性能評價
    5.4 本章小結(jié)
第6章 基于CRISPR/Cas12a介導(dǎo)的熒光分析方法檢測ATP及Na⁺研究
    6.1 主要試劑材料與儀器設(shè)備
        6.1.1 試劑材料
        6.1.2 儀器設(shè)備
    6.2 實驗方法與步驟
        6.2.1 ATP探針及信號溶液的制備
        6.2.2 CRISPR/Cas12a介導(dǎo)的熒光分析方法檢測ATP性能評價
        6.2.3 便攜熒光儀檢測ATP流程
        6.2.4 Na⁺檢測探針NaA43DNAzyme的制備
        6.2.5 CRISPR/Cas12a介導(dǎo)的熒光分析方法檢測Na⁺性評價
    6.3 結(jié)果與討論
        6.3.1 CRISPR/Cas12a介導(dǎo)的熒光分析方法檢測ATP可行性分析
        6.3.2 CRISPR/Cas12a介導(dǎo)的檢測ATP的熒光分析方法性能評價
        6.3.3 CRISPR/Cas12a介導(dǎo)的熒光分析方法檢測Na⁺的建立及性能評價
    6.4 本章小結(jié)
第7章 結(jié)論與展望
    7.1 結(jié)論
        7.1.1 MB@PAA@Nb磁性免疫親和提取法
        7.1.2 pH響應(yīng)ELISA高靈敏檢測AFB1

        7.1.3 等離子共振ELISA高靈敏檢測AFB₁

        7.1.4 熒光ELISA超靈敏檢測AFB₁

        7.1.5 CRISPR/Cas12a介導(dǎo)熒光分析方法檢測ATP及Na⁺

    7.2 展望
致謝
參考文獻(xiàn)
附錄1 試劑材料
附錄2 儀器設(shè)備
攻讀學(xué)位期間的研究成果
個人簡歷



本文編號：3862828

boshi