發(fā)布時間：2023-05-31 22:10

　　大豆分離蛋白在經(jīng)過酶解處理后,肽鏈的大量斷裂使肽鏈末端暴露出大量疏水性氨基酸殘基,使得水解液中產(chǎn)生苦味,亮氨酸氨肽酶可水解多肽N端的疏水氨基酸,減少疏水性多肽的含量,降低水解液中的苦味,從而解決大豆蛋白在食品加工上的一大難題。本論文將來自曲霉和嗜熱真菌的8個亮氨酸氨肽酶基因分別在宿主黑曲霉HL-1中進(jìn)行重組表達(dá),篩選得到高活性的亮氨酸氨肽酶基因lap A和The,并通過利用CRISPR/Cas9工具增加其基因拷貝數(shù)提高表達(dá)量,同時研究其純化工藝和酶學(xué)性質(zhì),以及探究重組亮氨酸氨肽酶Thelap和堿性蛋白酶復(fù)配水解大豆分離蛋白在脫苦方面的應(yīng)用,主要研究內(nèi)容如下:(1)將雜合啟動子Pna II分別與8個目的基因相連,構(gòu)建8個不同目的基因的表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化宿主無孢黑曲霉HL-1,篩選得到高活性基因lap A和The,轉(zhuǎn)化株Lap A-T和The-T亮氨酸氨肽酶活力分別可達(dá)到2212.3 U/m L和854.6 U/m L。為了進(jìn)一步提高亮氨酸氨肽酶在黑曲霉中的表達(dá)水平,利用CRISPR/Cas9技術(shù),增加亮氨酸氨肽酶基因在黑曲霉基因組中的拷貝數(shù),多拷貝轉(zhuǎn)化株Lap A-C和The-C亮氨酸氨肽酶...

【文章頁數(shù)】：97 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
第一章 緒論
    1.1 氨肽酶概述
        1.1.1 氨肽酶的來源和性質(zhì)
        1.1.2 氨肽酶的功能和用途
        1.1.3 氨肽酶的分類
    1.2 亮氨酸氨肽酶
        1.2.1 亮氨酸氨肽酶的簡介
        1.2.2 亮氨酸氨肽酶的應(yīng)用
    1.3 氨肽酶研究現(xiàn)狀
        1.3.1 增強(qiáng)氨肽酶生產(chǎn)和性能改進(jìn)的遺傳方法
        1.3.2 基因的過度表達(dá)和產(chǎn)量的提高
        1.3.3 提高氨肽酶的酶學(xué)性質(zhì)
    1.4 黑曲霉表達(dá)系統(tǒng)和基因編輯技術(shù)
    1.5 研究意義
    1.6 本論文研究內(nèi)容
第二章 亮氨酸氨肽酶的基因挖掘及其高效表達(dá)工程菌的篩選
    2.1 引言
    2.2 實(shí)驗(yàn)材料與設(shè)備
        2.2.1 質(zhì)粒與菌種
        2.2.2 引物設(shè)計(jì)
        2.2.3 實(shí)驗(yàn)材料
        2.2.4 實(shí)驗(yàn)設(shè)備
    2.3 實(shí)驗(yàn)方法
        2.3.1 本章所選取的亮氨酸氨肽酶基因
        2.3.2 氨肽酶表達(dá)載體的構(gòu)建
        2.3.3 無孢曲霉HL-1的轉(zhuǎn)化
        2.3.4 過量表達(dá)亮氨酸氨肽酶菌株的篩選
        2.3.5 過量表達(dá)亮氨酸氨肽酶菌株的搖瓶發(fā)酵
        2.3.6 亮氨酸氨肽酶活力的測定方法
        2.3.7 蛋白含量的檢測
    2.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論
        2.4.1 生物信息學(xué)分析
        2.4.2 氨肽酶表達(dá)載體的構(gòu)建
        2.4.3 不同亮氨酸氨肽酶基因表達(dá)菌株的轉(zhuǎn)化與鑒定
        2.4.4 重組亮氨酸氨肽酶表達(dá)菌株的酶活測定
    2.5 本章小結(jié)
第三章 利用CRISPR/Cas9 技術(shù)的表達(dá)策略提高氨肽酶基因lapA和 The的表達(dá)量
    3.1 引言
    3.2 實(shí)驗(yàn)材料與設(shè)備
        3.2.1 質(zhì)粒與菌種
        3.2.2 引物設(shè)計(jì)
        3.2.3 實(shí)驗(yàn)材料
        3.2.4 實(shí)驗(yàn)設(shè)備
    3.3 實(shí)驗(yàn)方法
        3.3.1 利用CRISPR/Cas9 基因編輯工具進(jìn)行無孢曲霉HL-1 的轉(zhuǎn)化
        3.3.2 過量表達(dá)亮氨酸氨肽酶基因轉(zhuǎn)化子的篩選和分析
        3.3.3 表達(dá)菌株目的基因拷貝數(shù)的測定
    3.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論
        3.4.1 lapA氨肽酶基因表達(dá)菌株的轉(zhuǎn)化結(jié)果及對比
        3.4.2 The氨肽酶基因表達(dá)菌株的轉(zhuǎn)化結(jié)果及對比
    3.5 本章小結(jié)
第四章 重組亮氨酸氨肽酶純化和酶學(xué)性質(zhì)研究及Thelap在大豆分離蛋白中的脫苦應(yīng)用
    4.1 引言
    4.2 實(shí)驗(yàn)材料與設(shè)備
        4.2.1 菌種
        4.2.2 實(shí)驗(yàn)材料
        4.2.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)備
    4.3 實(shí)驗(yàn)方法
        4.3.1 重組亮氨酸氨肽酶的蛋白純化研究
        4.3.2 重組亮氨酸氨肽酶的Western blot分析
        4.3.3 重組亮氨酸氨肽酶的酶學(xué)性質(zhì)研究
        4.3.4 重組亮氨酸氨肽酶Thelap在大豆分離蛋白中的脫苦應(yīng)用
    4.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論
        4.4.1 重組亮氨酸氨肽酶的蛋白純化結(jié)果
        4.4.2 重組亮氨酸氨肽酶LapA的酶學(xué)性質(zhì)研究
        4.4.3 重組亮氨酸氨肽酶Thelap的酶學(xué)性質(zhì)研究
        4.4.4 重組亮氨酸氨肽酶Thelap在大豆分離蛋白中的脫苦應(yīng)用
    4.5 本章小結(jié)
結(jié)論與展望
本論文創(chuàng)新點(diǎn)
參考文獻(xiàn)
攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文
致謝
附件



本文編號：3826094