炎癥是一種針對感染或損傷的適應性免疫反應。適度的炎癥反應對機體是有益的,但當發(fā)生失調(diào)慢性炎癥反應時,會引起一系列慢性疾�。ò┌Y,動脈粥樣硬化,類風濕關(guān)節(jié)炎等）。免疫球蛋白G（Ig G）是一種從健康哺乳動物血液中獲得的抗體,在脂多糖/植物凝集素誘導的細胞模型系統(tǒng)中表現(xiàn)出顯著的抗炎癥效果。雞蛋黃來源卵黃免疫球蛋白（IgY）在結(jié)構(gòu)和Ig G功能上相似,但是IgY比Ig G獲取的原材料簡單,產(chǎn)量高,具有對哺乳動物抗原有很高的親和力以及不與類風濕因子反應等特點。其IgY粗提物廣泛用于免疫活性和抗炎癥活性中。然而IgY的Fc片段不能激活哺乳動物體系相應的免疫調(diào)控機制,提高了IgY成為哺乳動物過敏原的風險。目前用來分離純化Fab和Fc片段方法常常多種色譜柱的聯(lián)合使用,方法昂貴復雜且費時。因此本論文在研究兩種蛋白酶酶解IgY活性片段的基礎上,提出了一種高效,綠色環(huán)保的Fab片段分離純化方法,制備高純度Fab片段。比較Fab片段和IgY結(jié)構(gòu)的差異,進一步闡述Fab片段和IgY在LPS（脂多糖）誘導的RAW264.5炎癥模型中的抗炎癥功效。研究內(nèi)容結(jié)果如下:第一,本章研究了木瓜蛋白酶和胃蛋白酶分解IgY得... 

【文章頁數(shù)】：120 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
縮略語表
第一章 緒論
    1 IgY的結(jié)構(gòu)與活性片段
    2 Fab和Fc片段的制備
        2.1 IgY的酶解方式
            2.2.1 木瓜蛋白酶酶解
            2.2.2 胃蛋白酶酶解
        2.2 Fab片段和Fc片段的分離純化
            2.2.1 鹽析
            2.2.2 超濾法
            2.2.3 色譜法
            2.2.4 Gradiflow技術(shù)
    3 IgY及其Fab片段抗炎癥活性研究
        3.1 炎癥的形成機理
        3.2 巨噬細胞的免疫調(diào)節(jié)
        3.3 哺乳動物免疫球蛋白IVIg和巨噬細胞的相互作用
            3.3.1 IVIg與巨噬細胞的膜表面受體的相互作用
            3.3.2 血紅素加氧酶-1通路
            3.3.3 IVIg毒中和作用
        3.4 Fab的抗炎癥活性研究
        3.5 IgY的應用研究進展
    4 選題意義
    5 研究內(nèi)容
第二章 兩種蛋白酶酶解制備IgY活性片段研究
    1 材料與方法
        1.1 材料與試劑
        1.2 主要儀器
        1.3 試驗方法
            1.3.1 IgY的制備
            1.3.2 IgY的表征
            1.3.2 蛋白質(zhì)的木瓜蛋白酶酶解條件優(yōu)化
            1.3.3 胃蛋白酶酶解條件優(yōu)化
            1.3.4 Western blotting試驗
            1.3.5 胃蛋白酶解制備Fab片段的分離純化
    2 結(jié)果與分析
        2.1 IgY非還原型SDS-PAGE電泳圖
        2.2 SEC-HPLC分析IgY樣品純度
        2.3 木瓜蛋白酶酶解條件優(yōu)化
            2.3.1 IgY和木瓜蛋白酶用量比
            2.3.2 半胱氨酸的用量
            2.3.3 酶解時間
            2.3.4 酶解條件的優(yōu)化
        2.4 胃蛋白酶酶解條件優(yōu)化
            2.4.1 IgY與胃蛋白酶質(zhì)量比對酶解效率的影響
            2.4.2 酶解時間對酶解效率的影響
        2.5 酶解溶液的western blotting分析
        2.6 胃蛋白酶解制備Fab片段的分離純化
    3 討論
    4 本章小結(jié)
第三章 IgY木瓜蛋白酶酶解Fab片段的分離純化
    1 材料與方法
        1.1 材料與試劑
        1.2 主要儀器
        1.3 試驗方法
            1.3.1 酶解溶液的制備
            1.3.2 IgY酶解溶液的超濾濃縮
            1.3.3 硫酸銨和氯化鈉鹽析對木瓜蛋白酶酶解溶液的影響
            1.3.4 陰離子交換色譜柱分離IgY木瓜蛋白酶酶解片段
            1.3.5 SDS-PAGE分析
            1.3.6 蛋白質(zhì)濃度測定
            1.3.7 Western blotting分析
            1.3.8 MALDI-TOF/TOF MS分析
    2 結(jié)果與討論
        2.1 超濾對IgY木瓜蛋白酶酶解片段的影響
        2.2 鹽析對IgY木瓜蛋白酶酶解溶液的影響
        2.3 陰離子交換色譜柱分離IgY木瓜蛋白酶酶解片段
            2.3.1 離子強度對陰離子交換色譜柱分離效果的影響
            2.3.2 pH值對陰離子交換色譜柱分離效果的影響
            2.3.3 IgY木瓜蛋白酶酶解片段的分離純化
            2.3.4 MALDI-TOF/TOF MS定性未知片段
        2.4 IgY酶解片段純度和得率計算
    3 討論
    4 小結(jié)
第四章 IgY及 Fab片段的蛋白構(gòu)象與理化性質(zhì)研究
    1 材料與方法
        1.1 材料
            1.1.1 主要試劑
            1.1.2 主要儀器
        1.2 方法
            1.2.1 傅里葉變換紅外光譜(FTIR)
            1.2.2 圓二色譜(CD)分析
            1.2.3 差示掃描量熱分析(DSC)
            1.2.4 紫外可見(UV-Vis)光譜掃描
            1.2.5 內(nèi)源性熒光光譜分析
            1.2.6 表面疏水性的測定
            1.2.7 分子排阻色譜分析(SEC-HPLC)
            1.2.8 動態(tài)光散射(DLS)粒徑分析
            1.2.9 Zeta電位測定
            1.2.10 數(shù)據(jù)分析
    2 結(jié)果與分析
        2.1 傅里葉變換紅外光譜分析
        2.2 圓二色譜分析
        2.3 差示掃描量熱分析
        2.4 熒光光譜分析
        2.5 紫外光譜分析
        2.6 蛋白質(zhì)表面疏水性
        2.7 蛋白質(zhì)的SEC-HPLC分析
        2.8 粒徑分布
        2.9 蛋白表面電荷分析
    3 討論
    4 本章小結(jié)
第五章 IgY及 Fab片段對脂多糖誘導RAW264.7 細胞的炎癥的影響
    1 材料與方法
        1.1 材料
            1.1.1 主要試劑
            1.1.2 主要儀器
        1.2 方法
            1.2.1 細胞培養(yǎng)
            1.2.2 細胞活性的測定
            1.2.3 炎癥因子的測定
            1.2.4 RT-PCR分析
            1.2.5 數(shù)據(jù)分析
    2 結(jié)果與分析
        2.1 RAW264.7巨噬細胞培養(yǎng)
        2.2 細胞活性的測定
        2.3 LPS誘導炎癥細胞的活性
        2.4 一氧化氮(NO)的測定
        2.5 前列腺素E2(PGE2)含量的測定
        2.6 COX-2 mRNA表達
        2.7 iNOS mRNA的表達
        2.8 TNF-α含量的測定
        2.9 IL-6含量的測定
        2.10 IL-10含量的測定
    3 討論
    4 小結(jié)
第六章 Fab片段對NF-κB和 MAPK信號通路關(guān)鍵蛋白的調(diào)控
    1 材料與方法
        1.1 材料
            1.1.1 主要試劑
            1.1.2 主要儀器
        1.2 方法
            1.2.1 細胞培養(yǎng)
            1.2.2 細胞活性測定
            1.2.3 qRT-PCR
            1.2.4 NF-κB和 MAPKs通路調(diào)節(jié)蛋白檢測
            1.2.5 激光共聚焦分析
            1.2.6 數(shù)據(jù)分析
    2 結(jié)果與分析
        2.1 細胞活性的測定
        2.2 qRT-PCR
        2.3 激光共聚焦分析
        2.4 NF-κB和 MAKPs調(diào)節(jié)蛋白檢測
    3 討論
    4 小結(jié)
第七章 結(jié)論與展望
    1 結(jié)論
    2 創(chuàng)新點
    3 展望
參考文獻
附錄 攻讀碩士學位期間研究成果
致謝



本文編號：3693925