谷胱甘肽（GSH）是一種有益于人體健康的抗氧化物質(zhì),在食品工業(yè)中有著廣泛的應(yīng)用,如作為保健品、食品添加劑等,還可以作為藥物治療某些疾病。而水稻是世界性的經(jīng)濟(jì)作物,是大部分地區(qū)的主食,提高稻米中的營養(yǎng)物質(zhì)是食品領(lǐng)域中的重點(diǎn)。GSH是一種植物或動(dòng)物的應(yīng)激性代謝產(chǎn)物,正常狀態(tài)下的植物體內(nèi)的GSH水平是不高的,本文欲通過遺傳改造提高水稻中的GSH含量。本文第二部分針對(duì)CATB、CATC各設(shè)計(jì)了2個(gè)靶點(diǎn),通過酶切、連接將啟動(dòng)子、g RNA與接頭靶點(diǎn)連在一起,再通過巢式PCR大量擴(kuò)增正確的連接產(chǎn)物,又稱g RNA表達(dá)盒,最后再經(jīng)過酶切、連接等步驟將g RNA表達(dá)盒與PYLCRISPR/Cas9連接,構(gòu)建了CRISPR/Cas9Pubi∷Os U∷CATC/CATB敲除載體。并且篩選出了6棵含Cas9的T0代陽性苗,陽性苗測序結(jié)果顯示出植株出現(xiàn)了單個(gè)堿基缺失、插入、替換,和部分片缺失等多種突變,6棵T0代陽性苗的CAT酶活都顯著下降。本文成功將CRISPR/Cas9多靶點(diǎn)敲除系統(tǒng)成功應(yīng)用在水稻中,獲得了打靶成功的陽性水稻植株,為提高水稻中GSH的含量的研究提供了基礎(chǔ)材料。同GSH一樣,抗壞血酸（AS... 

【文章來源】：合肥工業(yè)大學(xué)安徽省 211工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：77 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

GSH的化學(xué)結(jié)構(gòu)式Figure1.1ChemicalstructureofGSH

胖匾?饔謾Ｈ繽?.5所示，ASC在氧化應(yīng)激期間被氧化成不穩(wěn)定的自由基單氫抗壞血酸（Monodehydroascorbate，MDHA），MDHA會(huì)分解成ASC和DHA，MDHA在單氫抗壞血酸還原酶（Monodehydroascorbatereductase，MDHAR）的作用下還原為ASC，在DHAR的作用下形成ASC[50]。因此抗壞血酸過氧化物酶（APX）、MDHAR、DHAR是ASC循環(huán)再生的直接酶促成分。一般提高植物體內(nèi)的ASC的積累有三種常用的方式，生物合成酶的過表達(dá)，循環(huán)酶的過表達(dá)以及對(duì)抗壞血酸氧化酶的反義抑制，本文欲探究循環(huán)酶的功能，以期為提高ASC的水平的遺傳改造奠定基矗圖1.2ASC循環(huán)再生的機(jī)制圖[50]Figure1.2ThemechanismdiagramofASCcycleregeneration

合肥工業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文8圖1.3ZFNs和TALEN兩種基因編輯技術(shù)[62]Figure1.3Twogeneeditingtechnologies:ZFNsandTALEN1.5.3CRISPR/Cas9系統(tǒng)ZFNs的效率較低、費(fèi)用昂貴且影響脫靶的因素較多。TALENs的靶向非常精確，設(shè)計(jì)比ZFNs簡單，費(fèi)用比ZFNs便宜少許，但總體來說仍然較貴，該技術(shù)脫靶率較低，效率為一般水平，ZFNs、TALENs都是由蛋白特異性識(shí)別并結(jié)合靶DNA序列，因此ZFN和TALEN的載體構(gòu)建是一個(gè)復(fù)雜且耗時(shí)的過程，這種方式使得它們的應(yīng)用較為局限。最近的CRISPR/Cas9技術(shù)是基因編輯技術(shù)發(fā)展的重大飛躍，CRISPR/Cas9由向?qū)NA（sgRNA）和Cas9蛋白兩部分組成(圖1.2c)，與TALENs和ZFNs相比，CRISPR/Cas9的設(shè)計(jì)和構(gòu)建都較為簡單，且成本低、對(duì)細(xì)胞毒性孝打靶效率高，動(dòng)物、植物或微生物等都在該技術(shù)的適用范圍內(nèi)[62]。1.5.3.1CRISPR/Cas9技術(shù)的發(fā)展歷程CRISPR于1987年被首次報(bào)道，那時(shí)還未命名為CRISPR，日本科學(xué)在大腸桿菌的堿性磷酸酶同工酶轉(zhuǎn)化蛋白的3′端的側(cè)翼發(fā)現(xiàn)了特殊的結(jié)構(gòu)，即有5個(gè)高度同源的20bp核苷酸分別被32bp序列隔開[63]，但是該科學(xué)家并未對(duì)此特殊結(jié)構(gòu)深入研究。Mojica等于1993年在研究嗜鹽古細(xì)菌在不同鹽含量對(duì)PstI剪切的機(jī)制的影響時(shí)也發(fā)現(xiàn)了類似的回文對(duì)稱的序列的結(jié)構(gòu)[64]。1995年，Mojica在多種嗜鹽古細(xì)菌都發(fā)現(xiàn)了串聯(lián)重復(fù)序列[65]，并對(duì)這種序列進(jìn)行了報(bào)道，但還不能完全解釋這種結(jié)構(gòu)的確切的生物學(xué)作用。隨著科學(xué)家們的關(guān)注與深入研究，Jansen等于2002年將這種重復(fù)序列命名為“簇狀規(guī)則間隔的短回文重復(fù)序列（Theclusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats，CRISPR）”[66]，并總結(jié)了CRISPR的特點(diǎn)，CRISPR的重復(fù)序列被大小相似的非重復(fù)DNA隔開且這種直接重復(fù)序列的大小不等，從鼠傷寒沙門氏菌中的21b


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