隨著生活水平的提高,人們對(duì)美的追求也越來(lái)越高,皮膚光老化問(wèn)題也日益受到人們的廣泛關(guān)注。膠原蛋白肽被廣泛認(rèn)可具有改善皮膚光老化的功效,但是目前主要集中于膠原蛋白酶解物的活性評(píng)價(jià)以及膠原蛋白肽的分離鑒定,但是關(guān)于膠原蛋白肽的高效篩選以及定向制備方面的研究較少。因此,本課題以深海鱈魚(yú)皮為原料,以光損傷的成纖維細(xì)胞為模型,考察不同條件下酶解制備的膠原蛋白肽的抗皮膚光老化活性差異,并結(jié)合肽組學(xué)和peptide ranker等分析軟件,快速篩選出潛在具有抗光老化活性的膠原蛋白多肽,在此基礎(chǔ)上探究其保護(hù)成纖維細(xì)胞光損傷的作用機(jī)理,最后確定了定向制備高含量活性肽的鱈魚(yú)皮膠原蛋白肽的酶解工藝。本課題主要結(jié)果和結(jié)論如下:（1）分別采用酸性、中性、堿性蛋白酶制備不同水解度的鱈魚(yú)皮酶解物,對(duì)比分析了它們的蛋白質(zhì)回收率、水解度以及光損傷成纖維細(xì)胞的修復(fù)活性,結(jié)果發(fā)現(xiàn)堿性蛋白酶酶解5 h下的鱈魚(yú)皮酶解液水解效果最佳,其回收率和水解度達(dá)85.6%和20.55%;膠原酶抑制活性和光損傷成纖維細(xì)胞的細(xì)胞存活率也均為最高,分別為66.99%、73.56%,并且3種蛋白酶制備的酶解液的酶解效率和抗光老化活性都隨著酶解時(shí)間的... 

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皮膚結(jié)構(gòu)

第二章抗光老化的膠原蛋白肽的制備及其鑒定篩選31行時(shí)間質(zhì)譜（UPLC-Q-TOF-MS）方法，對(duì)胰蛋白酶消化的樣品的UPLC-MS數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析（PCA）以對(duì)這五種明膠進(jìn)行分類(lèi)，結(jié)合主成分分析（PCA），鑒定了阿膠，牛皮明膠，豬-隱形明膠，龜甲膠和鹿角膠的特征性的肽生物標(biāo)志物。Gallego等人[144]也通過(guò)過(guò)納米液相色譜與串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用方法，再結(jié)合主成分分析（PCA），使用無(wú)標(biāo)記方法對(duì)所有樣品中共有67種顯示蛋氨酸，脯氨酸和色氨酸氧化的肽進(jìn)行了共同鑒定，顯示出了加工9個(gè)月的西班牙干腌火腿期間氧化肽的演變過(guò)程。本文用PCA分析手段，目的是快速分析出不同酶解條件下的鱈魚(yú)皮酶解產(chǎn)物的差異肽和共性肽的情況。為了進(jìn)一步明確造成不同酶解條件下鱈魚(yú)皮酶解液的抗光老化活性差異的肽組成方面的原因，進(jìn)而快速篩選潛在的具有抗光老化活性的膠原蛋白多肽序列。首先，分析所有9個(gè)酶解產(chǎn)物進(jìn)行的分子特征峰PCA結(jié)果，由圖2-6可知，不同種酶作用的酶解產(chǎn)物相互離散，結(jié)果表明不同酶作用的酶解產(chǎn)物的肽段存在明顯的差異，同一種酶而不同酶解時(shí)間作用的酶解產(chǎn)物肽段相互聚集說(shuō)明它們之前存在一定的共性。注：PC1為第一主成分，PC2為第二主成分。圖2-6不同酶解條件下鱈魚(yú)皮酶解液的物分子特征峰PCA分析Fig.2-6PCAanalysisofmolecularcharacteristicpeaksofenzymolysissolutionofcodskinunderdifferentenzymatichydrolysisconditions為了進(jìn)一步分析，研究了3個(gè)Alcalase堿性蛋白酶（酶解1、3、5h）下的酶解產(chǎn)物進(jìn)行的PCA分析結(jié)果，由圖2-7可知同種酶不同水解度的酶解產(chǎn)物肽段相互聚集說(shuō)明它們之前存在一定的共性。

華南理工大學(xué)碩士學(xué)位論文32注：PC1是第一主成分，PC2為第二主成分圖2-7不同酶解時(shí)間的堿性蛋白酶的鱈魚(yú)皮酶解產(chǎn)物的分子特征峰PCA分析Fig.2-7PCAAnalysisofMolecularCharacteristicPeaksofCodSkinDigestionProductsofAlkalineProteasewithDifferentDigestionTime這一結(jié)果與前面其肽指紋圖譜的結(jié)果相吻合，不同酶解時(shí)間作用的酶解產(chǎn)物肽段相互聚集說(shuō)明它們之前存在一定的共性，同種酶不同水解度的酶解產(chǎn)物肽段相互聚集說(shuō)明它們之前存在一定的共性。2.3.9同種Alcalase堿性蛋白酶不同水解度的酶解產(chǎn)物共性肽段的鑒定和篩選基于指紋圖譜和PCA分析結(jié)果，通過(guò)質(zhì)譜分離鑒定，找到了84種其酶解產(chǎn)物中都存在的共性肽段，再基于<1500Da的小分子肽才具有較好的吸收利用度，因而進(jìn)一步篩選出78種小分子共性肽段，如下表2-5所示。

【參考文獻(xiàn)】：
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碩士論文
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[2]皮膚光老化機(jī)制研究—紫外線照射對(duì)成纖維細(xì)胞染色體端粒DNA復(fù)制的影響[D]. 馬慧敏.第四軍醫(yī)大學(xué) 2009
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