【摘要】：諾如病毒(Noroviruses,NoVs)是世界范圍內(nèi)引發(fā)非細(xì)菌性急性腸胃炎的主要病原體,貝類是NoVs傳播的重要載體之一,人們感染NoVs的常常與生食貝類或者食用加熱不徹底的貝類相關(guān)。我國(guó)是貝類養(yǎng)殖消費(fèi)大國(guó),NoVs污染貝類造成的食源性疾病,是貝類食品安全不容忽視的問(wèn)題。然而,目前NoVs尚不可體外培養(yǎng),貝類中污染的NoVs常因病毒含量少、基因型復(fù)雜、貝類成分干擾等原因,給貝類中NoVs含量、種類、分布等檢測(cè)帶來(lái)了困難;研究表明,牡蠣中存在類似人類組織血型抗原(HBGAs)的受體,可以特異性的結(jié)合牡蠣組織,但牡蠣中該受體與不同型別NoVs的結(jié)合機(jī)制尚不清楚。因此建立貝類中NoVs的快速檢測(cè)和分群分型方法,開展類HBGAs檢測(cè)和分布調(diào)查,研究NoVs脅迫下類HBGAs的變化與NoVs分布規(guī)律,探索牡蠣中NoVs與類HBGAs結(jié)合機(jī)制,對(duì)于開展貝類中NoVs準(zhǔn)確檢測(cè)、消費(fèi)預(yù)警、安全控制和抗病毒牡蠣品種的選育等,保障我國(guó)貝類產(chǎn)業(yè)可持續(xù)健康發(fā)展具有重要的意義。本文以NoVs為研究對(duì)象,建立了基于SYBR Green I熒光定量的貝類中NoVs快速檢測(cè)與分群的方法;建立了8種牡蠣中類HBGAs的檢測(cè)方法,初步探索了牡蠣中類HBGAs的分布規(guī)律;開展了NoVs脅迫下牡蠣中類HBGAs的變化與NoVs分布研究;制備了6種主要NoVs毒株的P粒子,解析了牡蠣中類HBGAs的結(jié)合特性,篩選了NoVs P粒子蛋白特異性分子探針,為深入探明NoVs在牡蠣中的結(jié)合機(jī)制奠定了基礎(chǔ),具體研究結(jié)果如下:1.貝類中NoVs的快速檢測(cè)與分群方法研究對(duì)比分析了6株主要流行的GI、GII諾如病毒及參考諾如病毒的基因序列,篩選并設(shè)計(jì)了保守區(qū)域引物,優(yōu)化建立了基于SYBR Green I熒光定量快速檢測(cè)與熔解曲線快速分群方法,并對(duì)實(shí)際樣品檢測(cè)驗(yàn)證,結(jié)果表明,引物P289/290可以同時(shí)檢測(cè)GI、GII諾如病毒,SYBR Green I熒光定量檢測(cè)方法在病毒10~3-10~9copies之間線性關(guān)系良好(R~2=0.993),熔解曲線Tm值能顯著區(qū)分GI和GII不同基因群的諾如病毒(p0.05);120份貝類樣品陽(yáng)性檢出率5.83%,其中陽(yáng)性結(jié)果測(cè)序鑒定與快速分群方法結(jié)論一致。該方法成本低,檢測(cè)快速,分群準(zhǔn)確,具有良好重復(fù)性,適用于貝類中GI、GII諾如病毒的快速檢測(cè)與分群。2.牡蠣中類HBGAs的檢測(cè)方法與分布規(guī)律研究?jī)?yōu)化了ELISA反應(yīng)中單克隆抗體的稀釋濃度、二抗?jié)舛?篩選了最佳洗板次數(shù)、封閉奶粉濃度、TMB顯色時(shí)間等因素,顯著降低了背景干擾,建立了8種類HBGAs的ELISA檢測(cè)方法。應(yīng)用建立的方法對(duì)240份牡蠣樣品中類HBGAs的分布和檢出率進(jìn)行了分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)牡蠣鰓組織中的含有較多的A、H1和Leb型類HBGAs,消化道和外套膜中含有較多的A和H1型類HBGAs;全年的檢測(cè)情況表明,A型類HBGAs分子在消化道、鰓和外套膜中的檢出率最高分別為100%、93.33%和95%;H1型和Leb型類HBGAs在牡蠣鰓中的檢出率較高分別為65.42%和89.58%;按照季節(jié)分類,牡蠣鰓、消化道、外套膜中的A型類HBGAs在四季中均有較高的檢出率(≥85%);而在閉殼肌中,A型類HBGAs高檢出率在春季和冬季,分別為63.3%和68.3%;牡蠣鰓中Leb型類HBGAs在四個(gè)季節(jié)中有較高的檢出率(≥71.7%),在所有的牡蠣組織中H1、Lea、Lex、Ley、Pre等類HBGAs檢出率均為春冬季節(jié)比夏秋季節(jié)高(p0.05);利用免疫組化方法對(duì)牡蠣不同部位中類HBGAs進(jìn)行了定位,結(jié)果發(fā)現(xiàn),牡蠣鰓、消化道和外套膜中A型類HBGAs分布明顯;H1型類HBGAs在牡蠣鰓和消化道組織中分布明顯,在外套膜中也有分布。綜上所述,不同牡蠣組織中存在不同類型的類HBGAs,且類HBGAs分布呈現(xiàn)多態(tài)性,并受季節(jié)影響。3.諾如病毒脅迫下類HBGAs的表達(dá)與NoVs分布規(guī)律實(shí)驗(yàn)室環(huán)境中將牡蠣暴露于GI.3/GII.4型NoVs中,經(jīng)過(guò)一定時(shí)間的生物性積累,檢測(cè)不同牡蠣組織中的類HBGAs表達(dá)變化,結(jié)果發(fā)現(xiàn),在污染GII.4 NoV后,A型類HBGAs的表達(dá)在牡蠣鰓、消化道、外套膜中顯著增加;在牡蠣污染GI.3 NoV或GII.4 NoV或兩者的混物后,牡蠣鰓和消化道組織中的H1型類HBGAs表達(dá)顯著增加;使用熒光定量RT-PCR方法同時(shí)檢測(cè)牡蠣不同組織中的NoVs含量,結(jié)果發(fā)現(xiàn)GI.3 NoV在牡蠣的鰓、消化道、外套膜、閉殼肌中均有檢出,但主要分布在消化道中(1.50±0.17)×10~7 copies,閉殼肌中最少,甚至有2個(gè)結(jié)果低于檢出限;GII.4 NoV在牡蠣的鰓、消化道、外套膜、閉殼肌也均有檢出,主要分布在鰓和消化道分別為(8.31±0.56)×10~6 copies和(1.77±0.62)×10~6 copies;當(dāng)牡蠣暴露于混合NoVs中時(shí),GI.3 NoV主要分布在消化道(7.26±1.44)×10~6 copies,GII.4 NoV則分布在鰓和消化道中,含量分別為(4.48±0.65)×10~6 copies和(1.11±0.13)×10~6 copies。在人工污染牡蠣48 h后的海水中沒(méi)有檢出NoVs。綜上所述,將GI.3、GII.4 NoVs暴露于牡蠣中,牡蠣選擇性的富集NoVs,NoVs脅迫影響牡蠣類HBGAs的表達(dá),該研究為探明NoVs與牡蠣HBGAs結(jié)合與調(diào)控奠定了基礎(chǔ)。4.人工污染諾如病毒在牡蠣中的蓄積與分布特性在實(shí)驗(yàn)室控制環(huán)境條件下,人工污染GII.4 NoV養(yǎng)殖太平洋牡蠣,以探討NoVs在太平洋牡蠣組織中的含量變化和分布特性。實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR結(jié)果表明:GII.4 NoVs在牡蠣外套膜中的含量比較穩(wěn)定,在(8.75±0.36)×10~4~(9.12±0.49)×10~4拷貝數(shù)之間;在牡蠣鰓中的含量先增加后減少,6 h到最高(1.15±0.15)×10~6拷貝數(shù);在牡蠣消化道中含量逐漸增加,12 h(1.06±0.14)×10~6拷貝數(shù)并趨于穩(wěn)定;24 h后主要分布于牡蠣的消化道組織中,凈化對(duì)牡蠣體內(nèi)富集的GII.4 NoV含量無(wú)顯著影響。免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示,GII.4 NoV廣泛分布在牡蠣外套膜邊緣、鰓璧和消化道內(nèi)壁上,其分布隨時(shí)間變化趨勢(shì)與實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR結(jié)果一致。本研究為進(jìn)一步研究NoVs在牡蠣中的生物積累規(guī)律、特異性結(jié)合機(jī)制,從而開展牡蠣中NoVs預(yù)警監(jiān)測(cè)和制定貝類凈化方案提供參考。5.不同型別諾如病毒P粒子的制備與體外結(jié)合特性利用六株主要流行的NoVs的PGEX-4T-1-P表達(dá)菌體,經(jīng)IPTG誘導(dǎo)、超聲破碎細(xì)胞后表達(dá)帶有GST蛋白標(biāo)簽的P粒子蛋白,經(jīng)過(guò)瓊脂糖凝膠4B對(duì)P粒子蛋白進(jìn)行純化,thrombin凝血酶去除GST標(biāo)簽,形成了二十四聚體的P粒子,成功制備GI NoVs P粒子大小32.6KDa,GII NoVs P粒子大小38KDa。利用制備的P粒子,體外與HBGAs結(jié)合實(shí)驗(yàn)表明,不同NoVs P粒子與人工合成寡糖H1型均有較強(qiáng)的結(jié)合,與其他類型具有結(jié)合多樣性;不同NoVs P粒子均與O+分泌型唾液結(jié)合,所有類型的NoVs P粒子與非分泌型唾液(O-)均不結(jié)合,其他類型具有多樣性結(jié)合;GI型(57397株、54108株、55063株)NoVs P粒子與牡蠣消化道組織提取液結(jié)合能力優(yōu)勢(shì)明顯,GII型(57395株、F278株、L20株)NoVs P粒子與牡蠣鰓、消化道、外套膜均有較強(qiáng)的結(jié)合能力,這三組結(jié)果均與牡蠣中NoVs積累分布具有一致性,可以間接證明,牡蠣中存在與NoVs結(jié)合的類HBGAs結(jié)合物質(zhì),這一結(jié)果可為后期NoVs與牡蠣類HBGAs的結(jié)合提供參考。6.諾如病毒P粒子蛋白特異性分子探針的篩選及應(yīng)用利用熒光適配體技術(shù),針對(duì)制備的NoVs P粒子蛋白,篩選出了5組特異性探針,經(jīng)過(guò)16輪的循環(huán)篩選,篩選出A1-3序列作為檢測(cè)NoVs P粒子蛋白的特異性序列,優(yōu)化的最佳的P粒子蛋白熒光適配體探針作用時(shí)間120 min,該序列特異性強(qiáng),靈敏度高,對(duì)篩選得到了A3-1序列經(jīng)過(guò)10種截短處理,篩選出了檢測(cè)NoVs P粒子蛋白的特性強(qiáng)更強(qiáng)、成本更低的截短序列A1-3-10,為NoVs的檢測(cè)奠定了新的思路和方法。
【學(xué)位授予單位】：上海海洋大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S944;TS254.7
【圖文】：

后來(lái)證明P2區(qū)是NoVs與人體受體結(jié)合區(qū)域[37]（圖1-2），P粒子蛋白具備了VLPs的功能，因此近年來(lái)的很多研究也使用P粒子[38, 39]來(lái)代替NoVs。圖 1-2 諾如病毒基因組及衣殼蛋白結(jié)構(gòu)Fig.1-2 Genome and capsid protein strcture of Norovirus1.1.2 我國(guó)諾如病毒的流行狀況諾如病毒在世界范圍內(nèi)暴發(fā)，可以引發(fā)各個(gè)年齡段人群的感染，主要引發(fā)急性腸胃炎病癥，一般在游輪、學(xué)校、監(jiān)獄、醫(yī)院等群體性或封閉公共場(chǎng)所暴發(fā)較多[40-44]。NoVs通過(guò)食源性途徑傳播，主要的傳播載體如貝類、生菜、草莓等[45]，在世界范圍內(nèi)均有相關(guān)的傳播報(bào)道，但在冬春季節(jié)常常是NoVs暴發(fā)的高峰期。我國(guó)未出現(xiàn)大規(guī)模的NoVs疫情

果發(fā)現(xiàn)有 53 份牡蠣中檢出了 NoVs 陽(yáng)性，檢出日本的生食牡蠣樣品進(jìn)行了檢測(cè)，發(fā)現(xiàn) 1512 個(gè)牡s 陽(yáng)性，而且 NoVs 類型多樣化；Suffredini 等[56]進(jìn)行了檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)有 31 個(gè)貝類樣品檢出了 NoVs enabbes 等[57]也對(duì) 77 份貝類樣品進(jìn)行了檢測(cè)，發(fā)因群 NoVs 的污染，陽(yáng)性率超過(guò) 30%，值得注意的道病毒及札如病毒等與 NoVs 類似的病毒污染卻011 英國(guó)暴發(fā)的 NoVs 案例進(jìn)行分析，證明英國(guó)的關(guān)聯(lián)；Tan 等[59]對(duì)中國(guó)廣西采集的 480 份牡蠣標(biāo) GII NoVs，檢出率為 20.7%，以 GII 為主；本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)[60, 61]，發(fā)現(xiàn)貝類中 NoVs 的檢出比較普遍（鏡照片見圖 1-3）。貝類中 NoVs 污染問(wèn)題已經(jīng)成患，在貝類國(guó)際貿(mào)易中被作為了監(jiān)控的重點(diǎn)因素

圖1-5 NoVs VLP和P粒子模型及HBGAs結(jié)合作用位點(diǎn)[146]Fig.1-5 The model of VLPs and P particles and the HBGA-binding site.2 貝類特異結(jié)合 NoVs 機(jī)制牡蠣在濾食海水的過(guò)程中，將NoVs吸入體內(nèi)，并且在牡蠣體內(nèi)生物性積累，Vs在牡蠣中生物性積累的機(jī)制尚不清楚，但是這種生物性積累不是被動(dòng)的積累是存在一定的主動(dòng)性。近年來(lái)，許多研究者根據(jù)人類HBGAs與NoVs結(jié)合機(jī)制，

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