【摘要】：植物甾醇是一種有效的降血膽固醇功能因子,但游離植物甾醇在油和水中溶解性差、熔點高,人體吸收和有效利用的效率差,也使其難以在食品和藥品中廣泛應用。為了解決這一問題,業(yè)界一般將植物甾醇衍生成植物甾醇酯。植物甾醇酯同樣具有顯著的降膽固醇功效,而其較高的脂溶性和較低的熔點提高了機體的吸收率,同時便于在食品和醫(yī)藥中應用。目前植物甾醇酯主要在無溶劑或有機體系中通過脂肪酶催化合成,但反應時間長、合成效率低。為了解決這問題,本文以β-谷甾醇月桂酸酯(β-SLE)為合成目標,通過構建反膠束(RM)酶體系,研究了其合成新方法,并且通過動物實驗,探討β-SLE降脂和降膽固醇的功能及其機理。主要研究結果如下:1.通過動態(tài)光散射技術確認構建了以Candida Rugosa lipase AY30(CRL AY30)為催化劑的水/雙(2-乙基己基)琥珀酸酯磺酸鈉(AOT)/異辛烷RM酶體系。通過逐步優(yōu)化法優(yōu)化RM酶體系結構,發(fā)現采用pH值為7.5的50 mmol/L磷酸緩沖鹽溶液作為親水核包裹CRL AY30,并且[CRL AY30](mg/mL):[水](mmol/L):[AOT](mmol/L)=3:375:25時,酶具有最大催化活性,且高于其在25 mmol/L AOT/異辛烷體系、375 mmol/L水/異辛烷體系或異辛烷體系中的活性。以β-谷甾醇25 mmol/L、醇酸比1:4、酶載量10%(w%總反應物)、反應溫度45℃的條件反應24 h后可合成55.62%β-SLE,48 h后合成72.71%β-SLE。上述結果表明水/AOT/異辛烷RM酶體系可用于β-SLE的合成。2.優(yōu)化了水/AOT/異辛烷RM酶體系中合成β-SLE的條件。采用薄層色譜法、高效液相色譜-三重四級桿串聯(lián)質譜法和紅外光譜法等定性方法確定β-SLE的合成,并采用高效液相色譜法(HPLC)對其進行定量檢測。經單因素實驗和響應面優(yōu)化后得最佳條件為:醇酸摩爾比1:3.5(25 mmol/Lβ-谷甾醇)、酶載量18%(w%總反應物)、反應溫度47℃、反應時間48 h,最終β-SLE的合成率為86.82%。3.以敘利亞金黃地鼠為動物模型,用0.2%膽固醇飼料和花生油建立高甘油三酯高膽固醇血癥模型,用低(11 mg/100 g體重)、中(22 mg/100 g體重)和高(44 mg/100 g體重)劑量的β-SLE連續(xù)灌喂6周,通過分析血清脂質、肝臟脂質、附睪脂肪和肝細胞形態(tài)、肝臟總脂肪酸組成后發(fā)現,β-SLE表現出顯著地降膽固醇效果,其中中劑量組效果最佳。較于模型組,中劑量組血清和肝臟中的總膽固醇分別顯著下降20.1%和33.6%(P0.05)。同時,β-SLE表現出顯著地降脂效果和調節(jié)脂質代謝的功能,其中中劑量組效果最佳。較于模型組,中劑量組血清和肝臟中的總甘油三酯分別下降30.9%(P0.05)和13.6%,且附睪脂肪組織和肝細胞減小最為明顯。此外,中劑量組的飽和脂肪酸及不飽和脂肪酸占比最接近空白對照組,分別為35.32%和63.19%(中劑量組),37.62%和60.75%(對照組),其n-6多不飽和脂肪酸與n-3多不飽和脂肪酸比值最佳,為4.32,以及中鏈脂肪酸占比最高,為模型組的3.00倍。通過測定肝臟功能性酶發(fā)現,β-SLE可提高肝臟谷胱甘肽-S-轉移酶(GST)的活性,相較于模型組,低、中和高劑量組的GST活性分別顯著提高59.4%、68.8%和66.2%(P0.05)。4.通過HPLC對糞便膽固醇含量進行測定。結果顯示,較于模型組,低、中和高劑量組中每克糞便膽固醇分別顯著提高13.2%、21.4%和65.9%(P0.05),表明β-SLE可以抑制膳食膽固醇的吸收。膽固醇小腸吸收相關酶的Elisa分析結果顯示,β-SLE主要通過抑制尼曼匹克C1類1蛋白1(NPC1L1)的表達來抑制膽固醇的吸收,其中中計量組效果最佳,相較于模型組,中劑量組可顯著下調22.6%的NPC1L1表達量(P0.05)。此外,相較于模型組,高攝入量的β-SLE可顯著抑制8.5%和9.3%的乙酰輔酶A乙�；D移酶-2和微粒體甘油三酯轉運蛋白表達量(P0.05)。通過超高速液相色譜-三重四級桿串聯(lián)質譜法對肝臟膽汁酸和糞便膽汁酸進行測定發(fā)現,肝臟中低、中和高劑量組總膽汁酸(TBA)含量隨劑量增大而增大,分別為148.018、281.303和830.205 ng/mg prot,均顯著低于模型組(P0.05),但中和高劑量組顯著高于對照組(P0.05)。糞便中低、中和高劑量組TBA含量也隨劑量增大而增大,分別為1030.507、1430.901和1566.969ng/mg prot,均顯著低于模型組但高于對照組(P0.05)。這些結果表明β-SLE可能可直接促進膽固醇在肝臟中分解合成膽汁酸和/或促進膽汁酸的排泄,間接促進膽固醇在肝臟中分解合成膽汁酸。進一步對肝臟中膽汁酸合成相關酶進行Elisa分析,結果顯示,相較于模型組,低、中和高劑量組可顯著上調7.6%、16.9%和12.3%的膽固醇7α羥化酶(CYP7A1)表達量(P0.05),中和高劑量組可顯著上調31.%和21.7%的甾醇27羥化酶(CYP27A1)表達量(P0.05)。回腸中膽汁酸重吸收相關酶的Elisa分析結果顯示,相較于模型組,低和中劑量組可顯著下調17.7%、14.5%的回腸頂端鈉依賴型膽汁酸轉運體表達量(P0.05)。這些結果表明β-SLE可能通過促進膽汁酸的排泄,從而促進膽固醇在肝中分解合成膽汁酸。此外,β-SLE對回腸膽汁酸結合蛋白(IBABP)、回腸法尼酯X受體(FXR)和肝臟FXR的表達具有抑制作用,這些酶的減少同樣可能減少CYP7A1和CYP27A1的表達�？紤]到高劑量組效果最佳,分別顯著性抑制28.7%、39.4%和26.4%的IBABP、回腸FXR和肝臟FXR表達量(P0.05),故β-SLE可能可直接作用于肝臟促進膽固醇分解,但需進一步證明�？傊�,β-SLE降膽固醇的機制可能為:1)降低膽固醇在小腸中的吸收;2)抑制膽汁酸在回腸中的重吸收,促進膽汁酸的排泄,從而促進膽固醇在肝中分解合成膽汁酸。
【學位授予單位】：南昌大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：O629.2;TS201.4
【圖文】：

圖 1.1 膽固醇及四種主要植物甾醇的結構Figure 1.1 The structure of cholesterol and four main kinds of phytosterols植物甾醇酯是植物甾醇的一類酯衍生物，一般由植物甾醇與脂肪酸通過酯化反應制得。游離的植物甾醇由于上述結構，在水和油脂中的溶解性都較差，且?guī)缀醪蝗苡诶湟掖己捅�，但易溶于氯仿和醚類，此外，其對熱和化學藥品很穩(wěn)定，熔點為 140~170℃[16]，這種性質使其人體吸收和有效利用的效率差，也使其難以在食品和藥品中廣泛應用[8]，與之相比，植物甾醇酯的熔點降低，油溶性提高，能增加 20 ~ 40%的生物利用率[10]，并且植物甾醇酯在人體小腸內會被水解成游離的植物甾醇[17]，故能保持與植物甾醇相似的降膽固醇功效[9]。表 1.1 主要油脂脫臭餾出物中的植物甾醇酯含量Table 1.1 The content of phytosterols in some main oil deodorizer distillate餾出物來源 含量（%） 餾出物來源 含量（%）大豆油 9 ~ 12 米糠油 4.9 ~ 19.2

該體系成為酶體系，可作為酶催化反應媒介[80]，如圖1.2 所示[81,82]，由于酶被包裹在極性核中，不與有機物質接觸，其催化活性得以保護[83]，且極性核呈納米水平分散，增加酶的擴散系數[84]，而非極性連續(xù)相又可以作為疏水性底物的合適溶劑，保證其反應濃度，解決了酶在非極性溶劑中活性低、底物在極性溶劑中溶解度低、兩者無溶劑中均擴散系數低的問題，最終提高反應效率。姜崇斌[85]等人利用 Novozym 堿性蛋白酶，在椰油酰胺丙基甜菜堿/正庚烷/正己醇 RM 酶體系中提取大豆蛋白，最終將提取率提高了 15.20%，達到74.28%；何進星[86]將乳酸脫氫酶固定在十六烷基三甲基溴化銨/辛烷/己醇 RM 中，并且將其用于測定試樣中乙醇的含量；王偉偉[87]研究了纖維素酶在鼠李糖脂 RM酶體系中降解纖維素的反應

圖 1.3 Rhizomucor miehei 脂肪酶活性位點的封閉（a）和開放（b）構象的卡通示意圖igure 1.3 Cartoon representation of the closed (a) and open (b) conformation of the active sitethe lipase from Rhizomucor miehei植物甾醇及酯降膽固醇功能研究的現狀高膽固醇血癥概述臨床上將高脂血癥簡單分為三類，分別為高甘油三酯高膽固醇血癥、高膽血癥及高甘油三酯血癥，其中高膽固醇血癥表示血中 TC 含量超過 mol/L[98]。Song[99]等人通過比較 2002 年和 2010 ~ 2012 年國人營養(yǎng)與健康相據發(fā)現，我國的血TC從2002年的3.93mmol/L上升到2012年的4.62mmol/L膽固醇血癥的患病率更是從 1.6%上升到了 6%。普遍認為，血 TC 或 LDL-C量與患動脈粥樣硬化疾病的風險呈現正相關，而動脈粥樣硬化又會進一步心血管疾�。ü谛牟。�。據統(tǒng)計，心血管疾病是全球主要的死亡原因，2016亡人數超過 1760 萬，預計到 2030 年將增加到 2360 萬以上，而 2019 年冠[1]

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1 陳丹陽;韓濤;;降膽固醇活性肽檢測方法的研究進展[J];中國食物與營養(yǎng);2019年12期

2 吳宇迪;;雙重降膽固醇新藥療效尚未定[J];心血管病防治知識;2008年05期

3 王鄭昊;陸國平;陳楨s

本文編號：2751605