【摘要】：植物甾醇是一種有效的降血膽固醇功能因子,但游離植物甾醇在油和水中溶解性差、熔點(diǎn)高,人體吸收和有效利用的效率差,也使其難以在食品和藥品中廣泛應(yīng)用。為了解決這一問題,業(yè)界一般將植物甾醇衍生成植物甾醇酯。植物甾醇酯同樣具有顯著的降膽固醇功效,而其較高的脂溶性和較低的熔點(diǎn)提高了機(jī)體的吸收率,同時(shí)便于在食品和醫(yī)藥中應(yīng)用。目前植物甾醇酯主要在無(wú)溶劑或有機(jī)體系中通過脂肪酶催化合成,但反應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)、合成效率低。為了解決這問題,本文以β-谷甾醇月桂酸酯(β-SLE)為合成目標(biāo),通過構(gòu)建反膠束(RM)酶體系,研究了其合成新方法,并且通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn),探討β-SLE降脂和降膽固醇的功能及其機(jī)理。主要研究結(jié)果如下:1.通過動(dòng)態(tài)光散射技術(shù)確認(rèn)構(gòu)建了以Candida Rugosa lipase AY30(CRL AY30)為催化劑的水/雙(2-乙基己基)琥珀酸酯磺酸鈉(AOT)/異辛烷RM酶體系。通過逐步優(yōu)化法優(yōu)化RM酶體系結(jié)構(gòu),發(fā)現(xiàn)采用pH值為7.5的50 mmol/L磷酸緩沖鹽溶液作為親水核包裹CRL AY30,并且[CRL AY30](mg/mL):[水](mmol/L):[AOT](mmol/L)=3:375:25時(shí),酶具有最大催化活性,且高于其在25 mmol/L AOT/異辛烷體系、375 mmol/L水/異辛烷體系或異辛烷體系中的活性。以β-谷甾醇25 mmol/L、醇酸比1:4、酶載量10%(w%總反應(yīng)物)、反應(yīng)溫度45℃的條件反應(yīng)24 h后可合成55.62%β-SLE,48 h后合成72.71%β-SLE。上述結(jié)果表明水/AOT/異辛烷RM酶體系可用于β-SLE的合成。2.優(yōu)化了水/AOT/異辛烷RM酶體系中合成β-SLE的條件。采用薄層色譜法、高效液相色譜-三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜法和紅外光譜法等定性方法確定β-SLE的合成,并采用高效液相色譜法(HPLC)對(duì)其進(jìn)行定量檢測(cè)。經(jīng)單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面優(yōu)化后得最佳條件為:醇酸摩爾比1:3.5(25 mmol/Lβ-谷甾醇)、酶載量18%(w%總反應(yīng)物)、反應(yīng)溫度47℃、反應(yīng)時(shí)間48 h,最終β-SLE的合成率為86.82%。3.以敘利亞金黃地鼠為動(dòng)物模型,用0.2%膽固醇飼料和花生油建立高甘油三酯高膽固醇血癥模型,用低(11 mg/100 g體重)、中(22 mg/100 g體重)和高(44 mg/100 g體重)劑量的β-SLE連續(xù)灌喂6周,通過分析血清脂質(zhì)、肝臟脂質(zhì)、附睪脂肪和肝細(xì)胞形態(tài)、肝臟總脂肪酸組成后發(fā)現(xiàn),β-SLE表現(xiàn)出顯著地降膽固醇效果,其中中劑量組效果最佳。較于模型組,中劑量組血清和肝臟中的總膽固醇分別顯著下降20.1%和33.6%(P0.05)。同時(shí),β-SLE表現(xiàn)出顯著地降脂效果和調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝的功能,其中中劑量組效果最佳。較于模型組,中劑量組血清和肝臟中的總甘油三酯分別下降30.9%(P0.05)和13.6%,且附睪脂肪組織和肝細(xì)胞減小最為明顯。此外,中劑量組的飽和脂肪酸及不飽和脂肪酸占比最接近空白對(duì)照組,分別為35.32%和63.19%(中劑量組),37.62%和60.75%(對(duì)照組),其n-6多不飽和脂肪酸與n-3多不飽和脂肪酸比值最佳,為4.32,以及中鏈脂肪酸占比最高,為模型組的3.00倍。通過測(cè)定肝臟功能性酶發(fā)現(xiàn),β-SLE可提高肝臟谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)的活性,相較于模型組,低、中和高劑量組的GST活性分別顯著提高59.4%、68.8%和66.2%(P0.05)。4.通過HPLC對(duì)糞便膽固醇含量進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果顯示,較于模型組,低、中和高劑量組中每克糞便膽固醇分別顯著提高13.2%、21.4%和65.9%(P0.05),表明β-SLE可以抑制膳食膽固醇的吸收。膽固醇小腸吸收相關(guān)酶的Elisa分析結(jié)果顯示,β-SLE主要通過抑制尼曼匹克C1類1蛋白1(NPC1L1)的表達(dá)來抑制膽固醇的吸收,其中中計(jì)量組效果最佳,相較于模型組,中劑量組可顯著下調(diào)22.6%的NPC1L1表達(dá)量(P0.05)。此外,相較于模型組,高攝入量的β-SLE可顯著抑制8.5%和9.3%的乙酰輔酶A乙�；D(zhuǎn)移酶-2和微粒體甘油三酯轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)量(P0.05)。通過超高速液相色譜-三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜法對(duì)肝臟膽汁酸和糞便膽汁酸進(jìn)行測(cè)定發(fā)現(xiàn),肝臟中低、中和高劑量組總膽汁酸(TBA)含量隨劑量增大而增大,分別為148.018、281.303和830.205 ng/mg prot,均顯著低于模型組(P0.05),但中和高劑量組顯著高于對(duì)照組(P0.05)。糞便中低、中和高劑量組TBA含量也隨劑量增大而增大,分別為1030.507、1430.901和1566.969ng/mg prot,均顯著低于模型組但高于對(duì)照組(P0.05)。這些結(jié)果表明β-SLE可能可直接促進(jìn)膽固醇在肝臟中分解合成膽汁酸和/或促進(jìn)膽汁酸的排泄,間接促進(jìn)膽固醇在肝臟中分解合成膽汁酸。進(jìn)一步對(duì)肝臟中膽汁酸合成相關(guān)酶進(jìn)行Elisa分析,結(jié)果顯示,相較于模型組,低、中和高劑量組可顯著上調(diào)7.6%、16.9%和12.3%的膽固醇7α羥化酶(CYP7A1)表達(dá)量(P0.05),中和高劑量組可顯著上調(diào)31.%和21.7%的甾醇27羥化酶(CYP27A1)表達(dá)量(P0.05)�；啬c中膽汁酸重吸收相關(guān)酶的Elisa分析結(jié)果顯示,相較于模型組,低和中劑量組可顯著下調(diào)17.7%、14.5%的回腸頂端鈉依賴型膽汁酸轉(zhuǎn)運(yùn)體表達(dá)量(P0.05)。這些結(jié)果表明β-SLE可能通過促進(jìn)膽汁酸的排泄,從而促進(jìn)膽固醇在肝中分解合成膽汁酸。此外,β-SLE對(duì)回腸膽汁酸結(jié)合蛋白(IBABP)、回腸法尼酯X受體(FXR)和肝臟FXR的表達(dá)具有抑制作用,這些酶的減少同樣可能減少CYP7A1和CYP27A1的表達(dá)�？紤]到高劑量組效果最佳,分別顯著性抑制28.7%、39.4%和26.4%的IBABP、回腸FXR和肝臟FXR表達(dá)量(P0.05),故β-SLE可能可直接作用于肝臟促進(jìn)膽固醇分解,但需進(jìn)一步證明�？傊�,β-SLE降膽固醇的機(jī)制可能為:1)降低膽固醇在小腸中的吸收;2)抑制膽汁酸在回腸中的重吸收,促進(jìn)膽汁酸的排泄,從而促進(jìn)膽固醇在肝中分解合成膽汁酸。
【學(xué)位授予單位】：南昌大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：O629.2;TS201.4
【圖文】：

圖 1.1 膽固醇及四種主要植物甾醇的結(jié)構(gòu)Figure 1.1 The structure of cholesterol and four main kinds of phytosterols植物甾醇酯是植物甾醇的一類酯衍生物，一般由植物甾醇與脂肪酸通過酯化反應(yīng)制得。游離的植物甾醇由于上述結(jié)構(gòu)，在水和油脂中的溶解性都較差，且?guī)缀醪蝗苡诶湟掖己捅�，但易溶于氯仿和醚類，此外，其�?duì)熱和化學(xué)藥品很穩(wěn)定，熔點(diǎn)為 140~170℃[16]，這種性質(zhì)使其人體吸收和有效利用的效率差，也使其難以在食品和藥品中廣泛應(yīng)用[8]，與之相比，植物甾醇酯的熔點(diǎn)降低，油溶性提高，能增加 20 ~ 40%的生物利用率[10]，并且植物甾醇酯在人體小腸內(nèi)會(huì)被水解成游離的植物甾醇[17]，故能保持與植物甾醇相似的降膽固醇功效[9]。表 1.1 主要油脂脫臭餾出物中的植物甾醇酯含量Table 1.1 The content of phytosterols in some main oil deodorizer distillate餾出物來源 含量（%） 餾出物來源 含量（%）大豆油 9 ~ 12 米糠油 4.9 ~ 19.2

該體系成為酶體系，可作為酶催化反應(yīng)媒介[80]，如圖1.2 所示[81,82]，由于酶被包裹在極性核中，不與有機(jī)物質(zhì)接觸，其催化活性得以保護(hù)[83]，且極性核呈納米水平分散，增加酶的擴(kuò)散系數(shù)[84]，而非極性連續(xù)相又可以作為疏水性底物的合適溶劑，保證其反應(yīng)濃度，解決了酶在非極性溶劑中活性低、底物在極性溶劑中溶解度低、兩者無(wú)溶劑中均擴(kuò)散系數(shù)低的問題，最終提高反應(yīng)效率。姜崇斌[85]等人利用 Novozym 堿性蛋白酶，在椰油酰胺丙基甜菜堿/正庚烷/正己醇 RM 酶體系中提取大豆蛋白，最終將提取率提高了 15.20%，達(dá)到74.28%；何進(jìn)星[86]將乳酸脫氫酶固定在十六烷基三甲基溴化銨/辛烷/己醇 RM 中，并且將其用于測(cè)定試樣中乙醇的含量；王偉偉[87]研究了纖維素酶在鼠李糖脂 RM酶體系中降解纖維素的反應(yīng)

圖 1.3 Rhizomucor miehei 脂肪酶活性位點(diǎn)的封閉（a）和開放（b）構(gòu)象的卡通示意圖igure 1.3 Cartoon representation of the closed (a) and open (b) conformation of the active sitethe lipase from Rhizomucor miehei植物甾醇及酯降膽固醇功能研究的現(xiàn)狀高膽固醇血癥概述臨床上將高脂血癥簡(jiǎn)單分為三類，分別為高甘油三酯高膽固醇血癥、高膽血癥及高甘油三酯血癥，其中高膽固醇血癥表示血中 TC 含量超過 mol/L[98]。Song[99]等人通過比較 2002 年和 2010 ~ 2012 年國(guó)人營(yíng)養(yǎng)與健康相據(jù)發(fā)現(xiàn)，我國(guó)的血TC從2002年的3.93mmol/L上升到2012年的4.62mmol/L膽固醇血癥的患病率更是從 1.6%上升到了 6%。普遍認(rèn)為，血 TC 或 LDL-C量與患動(dòng)脈粥樣硬化疾病的風(fēng)險(xiǎn)呈現(xiàn)正相關(guān)，而動(dòng)脈粥樣硬化又會(huì)進(jìn)一步心血管疾�。ü谛牟。�。據(jù)統(tǒng)計(jì)，心血管疾病是全球主要的死亡原因，2016亡人數(shù)超過 1760 萬(wàn)，預(yù)計(jì)到 2030 年將增加到 2360 萬(wàn)以上，而 2019 年冠[1]

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1 陳丹陽(yáng);韓濤;;降膽固醇活性肽檢測(cè)方法的研究進(jìn)展[J];中國(guó)食物與營(yíng)養(yǎng);2019年12期

2 吳宇迪;;雙重降膽固醇新藥療效尚未定[J];心血管病防治知識(shí);2008年05期

3 王鄭昊;陸國(guó)平;陳楨s

本文編號(hào)：2751605