【摘要】：甲殼素是由β-1,4-糖苷鍵相連接的N-乙酰-D-氨基葡萄糖殘基組成,是甲殼類動物(如蝦,蟹和貝類)外骨骼的主要組成成分。甲殼素是一種可再生的原料,自然界每年生物合成的甲殼素約有1000億噸之多約,其產(chǎn)量僅次于纖維素,是自然界中第二豐富的天然生物聚合物。甲殼素作為一種新型功能材料,在各個領(lǐng)域引起了廣泛關(guān)注。但是它不溶于水和大多數(shù)有機(jī)溶劑,這種性質(zhì)嚴(yán)重地限制了它的開發(fā)和應(yīng)用。甲殼素可通過完全脫乙�；虿糠置撘阴；⑺廪D(zhuǎn)化為殼寡糖(COS)。COS是一種結(jié)構(gòu)多樣的功能性生物聚合物家族。COS的結(jié)構(gòu)可用三個來描述參數(shù):聚合度(DP),乙酰化程度(DA)和乙�；Ｊ�(PA)即GlcN和GlcNAc的排列順序。雖然我們對COS分子中DP和DA的結(jié)構(gòu)功能關(guān)系有了基本的了解,但對PA的影響知之甚少。由于缺乏具有特定PA的COS和合適的分析方法,COS的PA的難以通過實驗解決,因此闡明殼聚糖的乙�；Ｊ胶头肿咏Y(jié)構(gòu)與功能之間的關(guān)系具有挑戰(zhàn)性。且化學(xué)法生產(chǎn)的殼聚糖總顯示出隨機(jī)的乙�；Ｊ�,相反,由幾丁質(zhì)脫乙酰酶(CDA)產(chǎn)生的COS可具有特定的乙�；Ｊ�,如一些細(xì)菌CDA所示。然而,與我們對細(xì)菌CDA的了解相比,我們對真菌CDA產(chǎn)生具有特定乙�；Ｊ降腃OS知之甚少。本論文從CAZY數(shù)據(jù)庫中調(diào)研得到來源于糖苷水解酶第四家族(Carbohydrate Esterase Family 4,CE 4)的幾丁質(zhì)脫乙酰酶(CDA)。以釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)為研究對象,表征了來自釀酒酵母的幾丁質(zhì)脫乙酰酶(ScCDA_2)詳細(xì)的脫乙�；瘷C(jī)制并對它的反應(yīng)產(chǎn)物(部分乙�；臍す烟�)進(jìn)行了分離。實驗表明ScCDA_2可以產(chǎn)生完全確定的COS解決了化學(xué)生產(chǎn)的殼寡糖乙�；Ｊ降碾S機(jī)化。ScCDA_2還分別對結(jié)晶幾丁質(zhì)和膠體幾丁質(zhì)表現(xiàn)出約8%和20%的脫乙�；钚�。此外,開發(fā)了一種通過高效液相色譜和電噴霧電離質(zhì)譜(HPLC-ESI-MS)系統(tǒng)分離和檢測部分乙�；瘹ぞ厶枪烟堑姆椒�,該方法快速方便,可在線監(jiān)測。質(zhì)譜測序顯示,ScCDA_2分別產(chǎn)生具有DAAA,ADAA,AADA,DDAA,DADA,ADDA和DDDA的特異性乙酰化模式的COS。因此,Sc CDA_2不會使最靠近低聚物還原端的GlcNAc單元去乙�；�,ScCDA_2對幾丁質(zhì)寡糖具有多重攻擊的催化機(jī)制。這種特定的作用模式顯著地豐富了現(xiàn)有的幾丁質(zhì)脫乙酰酶脫乙�；Ｊ綆�。這些完全定義的COS可用于COS結(jié)構(gòu)和功能的研究。
【學(xué)位授予單位】：大連海洋大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：TS261.11
【圖文】：

生物概述源及分類素、甲殼質(zhì)、幾丁聚糖是由 N-乙酰氨基葡萄糖（GlcN葡萄糖單元之間的鍵）連接的線性多糖[1]，如圖 1 所殼類動物（如螃蟹，龍蝦和蝦）和昆蟲的外骨骼的主洋生態(tài)系統(tǒng)中含量最豐富的多糖，其產(chǎn)量僅次于纖維型的結(jié)晶形式 α，β 和 γ 存在，并且他們的乙酰化程度細(xì)胞壁、蝦殼，昆蟲表皮以及蟹和龍蝦腱和殼中。在列[4]。因此，α-幾丁質(zhì)在自然界中是最穩(wěn)定形式的幾）的甲殼素原纖維[5]。β-幾丁質(zhì)通常存在于魷魚的內(nèi)骨平行取向排列，并且?guī)锥≠|(zhì)纖維的結(jié)晶度指數(shù)為約 70得該形式更具反應(yīng)性且易溶于溶劑[2]。γ-幾丁質(zhì)由 α-和條平行的聚合物鏈與一條反平行鏈交替排列[6]。

圖 1.2：酶法殼聚糖的形成的示意圖Fig1.2：Schematic diagram of the formation process of chitosan by enzymes.聚糖的脫乙酰度（％DD）可以通過 NMR 光譜測定，商業(yè)殼聚糖中的％DD 0％。平均而言，商業(yè)生產(chǎn)的殼聚糖的分子量為 3800 至 20,000 道爾頓。合成殼聚方法是使用過量的氫氧化鈉作為試劑和水作為溶劑使殼多糖脫乙酰化[10]。盡管反進(jìn)行，但遵循一級動力學(xué);第一階段的活化能壘在 25-120℃時估計為 48.8 kJ mol-二階段的屏障[11]。當(dāng)允許幾丁質(zhì)完全脫乙�；瘯r，該反應(yīng)途徑產(chǎn)生高達(dá) 98％的產(chǎn)物中的氨基具有~6.5 的 pKa 值，這導(dǎo)致中性溶液中的顯著質(zhì)子化，隨著酸度的增加這使得殼聚糖具有水溶性和生物粘附性，并且易于結(jié)合帶負(fù)電的表面，如粘膜。夠增強(qiáng)極性藥物在上皮表面的轉(zhuǎn)運，并且是生物相容的和可生物降解的[12]。盡管尚未獲得 FDA 批準(zhǔn)用于藥物輸送。純凈的殼聚糖可用于生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用，研究發(fā)和殼聚糖可用于制備納米纖維[13]。

脫乙酰酶之間進(jìn)行基于結(jié)構(gòu)的多序列比對。ScCDA2的序列與來自海洋節(jié)的 ArCE4A 序列，來自淺青紫鏈霉菌（Streptomyces lividans）的 S1CE肺炎鏈球菌（Streptococcus pneumoniae）的 SpPgdA 序列（PDB ID：2C色背景突出顯示，催化氨基酸標(biāo)記為黃色三角形。能夠與 Zn2+形成配位。序列上方的符號代表二級結(jié)構(gòu)，螺旋代表 α-螺旋，箭頭代表 β 折疊。ture-based on sequence alignments between four CDAs. The sequence ofA sequences from a marine Arthrobacter species (PDB ID: 5LFZ), the Sllividans (PDB ID: 2CC0) and the SpPgdA sequence from Streptococcus pneunserved motifs are highlighted by a red background and the catalytic amw triangle. Amino acids capable of forming coordinate bonds with Zn2+aresymbol above the sequence represents the secondary structure, helices represents the beta fold.乙酰酶 ScCDA2基因克隆

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本文編號：2749391