【摘要】：乳鐵蛋白(Lactoferrin,LF)作為一種鐵結(jié)合糖蛋白,具有抗菌、抗癌、抗炎以及免疫活性,其生物學(xué)作用日益被關(guān)注。牛乳鐵蛋白作為一種食物來(lái)源的蛋白質(zhì),可商業(yè)化生產(chǎn)并用作食品營(yíng)養(yǎng)添加劑,有利于消費(fèi)者機(jī)體健康。許多微量元素具有重要生物功能,在免疫系統(tǒng)中也發(fā)揮重要作用,提高機(jī)體的免疫功能。然而,尚未確定微量元素增補(bǔ)對(duì)乳鐵蛋白的免疫和抗炎活性是否有影響作用。為此,本課題將牛乳鐵蛋白分別增補(bǔ)銅/鋅0.16、0.32和0.64mg/g蛋白質(zhì),然后評(píng)估乳鐵蛋白及其銅鋅增補(bǔ)乳鐵蛋白的免疫和抗炎活性。采用小鼠脾細(xì)胞和小鼠巨噬細(xì)胞(RAW264.7)為體外模型,評(píng)估所選樣品的免疫活性;另外,以脂多糖誘導(dǎo)的小鼠巨噬細(xì)胞(RAW264.7)為炎癥模型,評(píng)估所選樣品的其抗炎活性;最終,揭示銅鋅增補(bǔ)對(duì)乳鐵蛋白的免疫和抗炎活性的影響作用。通過(guò)利用CCK-8法,確定牛乳鐵蛋白及銅鋅增補(bǔ)乳鐵蛋白在所選用的3個(gè)濃度下(10、20和40μg/mL)對(duì)脾細(xì)胞、ConA誘導(dǎo)的T淋巴細(xì)胞和LPS誘導(dǎo)的B淋巴細(xì)胞的增殖抑制作用大小,采用中性紅法測(cè)定RAW264.7巨噬細(xì)胞吞噬作用,流式細(xì)胞儀測(cè)定T淋巴細(xì)胞亞群分型(CD4~+和CD8~+)的比例,ELISA法測(cè)定細(xì)胞因子含量(干擾素-γ、白細(xì)胞介素-2和白細(xì)胞介素-4,脾細(xì)胞;腫瘤壞死因子-α和白細(xì)胞介素-1β,巨噬細(xì)胞),最終確定銅鋅增補(bǔ)對(duì)乳鐵蛋白體外免疫活性的影響。結(jié)果表明,乳鐵蛋白和銅鋅增補(bǔ)乳鐵蛋白對(duì)脾細(xì)胞、ConA誘導(dǎo)的T淋巴細(xì)胞和LPS誘導(dǎo)的B淋巴細(xì)胞均有一定的增殖抑制作用。低水平銅/鋅增補(bǔ)(0.16mg/g蛋白質(zhì))和低劑量(10μg/mL)確實(shí)能夠顯著地減緩乳鐵蛋白對(duì)脾細(xì)胞的抑制作用(P0.05)。與乳鐵蛋白相比,低水平銅鋅增補(bǔ)的乳鐵蛋白在低劑量下對(duì)巨噬細(xì)胞的刺激作用略微增加,提高ConA刺激的脾細(xì)胞中T淋巴細(xì)胞亞群CD4~+/CD8~+比例,同時(shí),顯著地明顯促進(jìn)脾淋巴細(xì)胞分泌細(xì)胞因子(IL-2、IL-4和IFN-γ)和RAW264.7巨噬細(xì)胞分泌細(xì)胞因子(IL-1β和TNF-α)(P0.05)。然而,與在低劑量下的結(jié)果相比,大多數(shù)情況下,高水平銅鋅增補(bǔ)(0.64 mg/g蛋白質(zhì))的乳鐵蛋白在高劑量下對(duì)這些細(xì)胞產(chǎn)生相反的作用。整體上,銅鋅增補(bǔ)乳鐵蛋白能夠減緩或增加乳鐵蛋白對(duì)兩種免疫細(xì)胞的影響。利用CCK-8法,確定牛乳鐵蛋白及銅增補(bǔ)乳鐵蛋白在所選用的4個(gè)濃度下(10、20、40和80μg/mL)對(duì)脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞細(xì)胞活性的影響。測(cè)定乳酸脫氫酶(LDH)活力進(jìn)行細(xì)胞毒性測(cè)定,采用Griess法測(cè)定巨噬細(xì)胞分泌的NO含量,DCFH-DA法測(cè)定RAW264.7巨噬細(xì)胞內(nèi)的活性氧(ROS)水平,ELISA法測(cè)定RAW264.7巨噬細(xì)胞釋放的PGE_2、TNF-α、IL-6和IL-1β含量,最終確定銅增補(bǔ)對(duì)乳鐵蛋白抗炎活性的影響。結(jié)果表明,乳鐵蛋白和銅增補(bǔ)乳鐵蛋白對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞分泌NO、PGE_2、TNF-α、IL-6和IL-1β炎性介質(zhì)和細(xì)胞中ROS水平均有一定抑制作用,表明其具有抗炎活性。與乳鐵蛋白相比,低水平銅增補(bǔ)并在低劑量下的乳鐵蛋白的抗炎效果更為明顯(P0.05)。綜上所述,銅鋅增補(bǔ)能夠降低或增強(qiáng)乳鐵蛋白的免疫作用或抗炎活性,并且低水平銅鋅增補(bǔ)、低劑量下產(chǎn)生更強(qiáng)的免疫作用和抗炎活性。所以,Cu~(2+)/Zn~(2+)含量是影響乳鐵蛋白免疫作用或抗炎活性的重要因素之一。
【學(xué)位授予單位】：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：TS201.21
【圖文】：

是生物活性。鐵飽和型乳鐵蛋白（即 holo-LF）對(duì)蛋白水解的抗性增加癌活性增加，抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)[3,82]。缺鐵型乳鐵蛋白（即 apo-LF）能夠平促進(jìn)巨噬細(xì)胞的吞噬活性[83]。除了鐵，其他微量元素結(jié)合乳鐵蛋白也會(huì)活性的改變。例如，增補(bǔ)硒能夠提高乳鐵蛋白的抗氧化作用[84]；而乳鐵蛋脊髓灰質(zhì)炎病毒 I 型感染和嗜肺軍團(tuán)菌的抑制作用增加[85,86]。KLFVPALLSLGALGLCLAAPRKNVRWCTISQPEWFKCRRWQWRMKKLGAVRRAFALECIRAIAEKKADAVTLDGGMVFEAGRDPYKLRPVAAEIYGTKEYYAVAVVKKGSNFQLDQLQGRKSCHTGLGRSAGWIIPMGILRPYLSWTESGAVAKFFSASCVPCIDRQAYPNLCQLCKGEGENQCACSSREPYFGYSGAFGAGDVAFVKETTVFENLPEKADRDQYELLCLNNSRAPVDAFKECHLAQVVARSVDGKEDLIWKLLSKAQEKFGKNKSRSFQLFGSPPGQRDLLFKDSALPSKVDSALYLGSRYLTTLKNLRETAEEVKARYTRVVWCAVGPEEQKKCQQQSGQNVTCATASTTDCIVLVLKGEADALNLDGGYIYTAGKCGLVPVLAENKHSSLDCVLRPTEGYLAVAVVKKANEGLTWNSLKDKKSCHTAVDRTAGWGLIVNQTGSCAFDEFFSQSCAPGADPKSRLCALCGDDQGLDKCVPNSKEKTGAFRCLAEDVGDVAFVKNDTVWENTNGESTADWAKNLNREDFRLLCL圖 1-1 牛乳鐵蛋白一級(jí)結(jié)構(gòu)序列（NCBI, L08604）Fig.1-1 Primary structure of Bovine LF

CO2培養(yǎng)箱 HF-90 力康公司/美國(guó)電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 HPG-9245 東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司電熱恒溫培養(yǎng)箱 DHP-9272 哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司/中國(guó)電子分析天平 TE 601-1 北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司精密 pH 計(jì) DELTA 320 Mettlor Toledo/中國(guó)恒溫水浴鍋 DFD-700 東方電工機(jī)械廠(chǎng)/中國(guó)旋渦混合器 XW-80A 上海青浦滬西儀器廠(chǎng)消化爐 HYP-II 上海纖檢儀器有限公司/中國(guó)流式細(xì)胞儀 FACS Calibur Becton Dickson/美國(guó)倒置電子顯微鏡 JEM-1200EX 日本日立公司低速臺(tái)式離心機(jī) TGL-16B 上海安亭科學(xué)儀器廠(chǎng)/中國(guó)酶標(biāo)儀 Model 680 BIO-RAD /美國(guó)超凈工作臺(tái) HVD-1320 北京東聯(lián)哈爾儀器公司/中國(guó)全自動(dòng)凱氏定氮儀 Foss2400 Foss 公司/中國(guó)3 研究的技術(shù)路線(xiàn)究的技術(shù)路線(xiàn)如圖 2-1 所示：

F、LF-Cu-10 和 LF-Cu-40 對(duì) ConA 誘導(dǎo)的脾細(xì)胞中 T 淋巴細(xì)胞亞群分型的影CD4+; Q1：CD8+）白對(duì)照； (B)：LF（10 μg/mL）；(C)：LF-Cu-10（10 μg/mL）；(D)：LF-C；(E)：LF（40 μg/mL）；(F)：LF-Cu-10（40 μg/mL）；(G)：LF-Cu-40（40 Effects of LF, LF-Cu-10, and LF-Cu-40 on T-lymphocyte subpopulations (Q4, C in ConA-stimulated splenocytes. The cells were cultured with culture medium atreated with LF, LF-Cu-10, and LF-Cu-40 at dose level of 10 μg/mL (B D), or trethem at dose level of 40 μg/mL (E G), respectively.空白組細(xì)胞相比，LF-Zn-10 處理的細(xì)胞 CD4+比例增加（36.9-40.4%），CD 15.4%）。LF-Zn-10 在 10 μg/mL 劑量下對(duì) CD4+呈現(xiàn)較強(qiáng)的刺激作用，而在 激作用減弱。對(duì) CD8+來(lái)說(shuō)，LF-Zn-10在 10 μg/mL劑量下的作用不顯著而在現(xiàn)出一定的抑制作用。LF-Zn-40 在 10 μg/mL 劑量下顯示出刺激作用，CD.5%，但是 CD8+比例變化不顯著（為 15.6%）。然而，LF-Zn-40 在 40 μg/m的抑制作用，CD4+和 CD8+比例均下降�？偠灾�，LF-Zn-10 和 LF-Zn-40 在 能導(dǎo)致 CD4+比例增加，而在 40 μg/mL 劑量下導(dǎo)致 CD4+比例降低或增加幅是，LF-Zn-10 和 LF-Zn-40 處理后，CD4+/CD8+值分別為 2.62 2.79 和 2.210 和 LF-Zn-40 分別顯示出最強(qiáng)和最弱的能力來(lái)提高 CD4+/CD8+比例。這些結(jié)

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本文編號(hào)：2743486