【摘要】：乳鐵蛋白(Lactoferrin,LF)作為一種鐵結(jié)合糖蛋白,具有抗菌、抗癌、抗炎以及免疫活性,其生物學(xué)作用日益被關(guān)注。牛乳鐵蛋白作為一種食物來源的蛋白質(zhì),可商業(yè)化生產(chǎn)并用作食品營養(yǎng)添加劑,有利于消費者機體健康。許多微量元素具有重要生物功能,在免疫系統(tǒng)中也發(fā)揮重要作用,提高機體的免疫功能。然而,尚未確定微量元素增補對乳鐵蛋白的免疫和抗炎活性是否有影響作用。為此,本課題將牛乳鐵蛋白分別增補銅/鋅0.16、0.32和0.64mg/g蛋白質(zhì),然后評估乳鐵蛋白及其銅鋅增補乳鐵蛋白的免疫和抗炎活性。采用小鼠脾細(xì)胞和小鼠巨噬細(xì)胞(RAW264.7)為體外模型,評估所選樣品的免疫活性;另外,以脂多糖誘導(dǎo)的小鼠巨噬細(xì)胞(RAW264.7)為炎癥模型,評估所選樣品的其抗炎活性;最終,揭示銅鋅增補對乳鐵蛋白的免疫和抗炎活性的影響作用。通過利用CCK-8法,確定牛乳鐵蛋白及銅鋅增補乳鐵蛋白在所選用的3個濃度下(10、20和40μg/mL)對脾細(xì)胞、ConA誘導(dǎo)的T淋巴細(xì)胞和LPS誘導(dǎo)的B淋巴細(xì)胞的增殖抑制作用大小,采用中性紅法測定RAW264.7巨噬細(xì)胞吞噬作用,流式細(xì)胞儀測定T淋巴細(xì)胞亞群分型(CD4~+和CD8~+)的比例,ELISA法測定細(xì)胞因子含量(干擾素-γ、白細(xì)胞介素-2和白細(xì)胞介素-4,脾細(xì)胞;腫瘤壞死因子-α和白細(xì)胞介素-1β,巨噬細(xì)胞),最終確定銅鋅增補對乳鐵蛋白體外免疫活性的影響。結(jié)果表明,乳鐵蛋白和銅鋅增補乳鐵蛋白對脾細(xì)胞、ConA誘導(dǎo)的T淋巴細(xì)胞和LPS誘導(dǎo)的B淋巴細(xì)胞均有一定的增殖抑制作用。低水平銅/鋅增補(0.16mg/g蛋白質(zhì))和低劑量(10μg/mL)確實能夠顯著地減緩乳鐵蛋白對脾細(xì)胞的抑制作用(P0.05)。與乳鐵蛋白相比,低水平銅鋅增補的乳鐵蛋白在低劑量下對巨噬細(xì)胞的刺激作用略微增加,提高ConA刺激的脾細(xì)胞中T淋巴細(xì)胞亞群CD4~+/CD8~+比例,同時,顯著地明顯促進脾淋巴細(xì)胞分泌細(xì)胞因子(IL-2、IL-4和IFN-γ)和RAW264.7巨噬細(xì)胞分泌細(xì)胞因子(IL-1β和TNF-α)(P0.05)。然而,與在低劑量下的結(jié)果相比,大多數(shù)情況下,高水平銅鋅增補(0.64 mg/g蛋白質(zhì))的乳鐵蛋白在高劑量下對這些細(xì)胞產(chǎn)生相反的作用。整體上,銅鋅增補乳鐵蛋白能夠減緩或增加乳鐵蛋白對兩種免疫細(xì)胞的影響。利用CCK-8法,確定牛乳鐵蛋白及銅增補乳鐵蛋白在所選用的4個濃度下(10、20、40和80μg/mL)對脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞細(xì)胞活性的影響。測定乳酸脫氫酶(LDH)活力進行細(xì)胞毒性測定,采用Griess法測定巨噬細(xì)胞分泌的NO含量,DCFH-DA法測定RAW264.7巨噬細(xì)胞內(nèi)的活性氧(ROS)水平,ELISA法測定RAW264.7巨噬細(xì)胞釋放的PGE_2、TNF-α、IL-6和IL-1β含量,最終確定銅增補對乳鐵蛋白抗炎活性的影響。結(jié)果表明,乳鐵蛋白和銅增補乳鐵蛋白對LPS誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞分泌NO、PGE_2、TNF-α、IL-6和IL-1β炎性介質(zhì)和細(xì)胞中ROS水平均有一定抑制作用,表明其具有抗炎活性。與乳鐵蛋白相比,低水平銅增補并在低劑量下的乳鐵蛋白的抗炎效果更為明顯(P0.05)。綜上所述,銅鋅增補能夠降低或增強乳鐵蛋白的免疫作用或抗炎活性,并且低水平銅鋅增補、低劑量下產(chǎn)生更強的免疫作用和抗炎活性。所以,Cu~(2+)/Zn~(2+)含量是影響乳鐵蛋白免疫作用或抗炎活性的重要因素之一。
【學(xué)位授予單位】：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：TS201.21
【圖文】：

是生物活性。鐵飽和型乳鐵蛋白（即 holo-LF）對蛋白水解的抗性增加癌活性增加，抑制腫瘤細(xì)胞生長[3,82]。缺鐵型乳鐵蛋白（即 apo-LF）能夠平促進巨噬細(xì)胞的吞噬活性[83]。除了鐵，其他微量元素結(jié)合乳鐵蛋白也會活性的改變。例如，增補硒能夠提高乳鐵蛋白的抗氧化作用[84]；而乳鐵蛋脊髓灰質(zhì)炎病毒 I 型感染和嗜肺軍團菌的抑制作用增加[85,86]。KLFVPALLSLGALGLCLAAPRKNVRWCTISQPEWFKCRRWQWRMKKLGAVRRAFALECIRAIAEKKADAVTLDGGMVFEAGRDPYKLRPVAAEIYGTKEYYAVAVVKKGSNFQLDQLQGRKSCHTGLGRSAGWIIPMGILRPYLSWTESGAVAKFFSASCVPCIDRQAYPNLCQLCKGEGENQCACSSREPYFGYSGAFGAGDVAFVKETTVFENLPEKADRDQYELLCLNNSRAPVDAFKECHLAQVVARSVDGKEDLIWKLLSKAQEKFGKNKSRSFQLFGSPPGQRDLLFKDSALPSKVDSALYLGSRYLTTLKNLRETAEEVKARYTRVVWCAVGPEEQKKCQQQSGQNVTCATASTTDCIVLVLKGEADALNLDGGYIYTAGKCGLVPVLAENKHSSLDCVLRPTEGYLAVAVVKKANEGLTWNSLKDKKSCHTAVDRTAGWGLIVNQTGSCAFDEFFSQSCAPGADPKSRLCALCGDDQGLDKCVPNSKEKTGAFRCLAEDVGDVAFVKNDTVWENTNGESTADWAKNLNREDFRLLCL圖 1-1 牛乳鐵蛋白一級結(jié)構(gòu)序列（NCBI, L08604）Fig.1-1 Primary structure of Bovine LF

CO2培養(yǎng)箱 HF-90 力康公司/美國電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 HPG-9245 東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司電熱恒溫培養(yǎng)箱 DHP-9272 哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司/中國電子分析天平 TE 601-1 北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司精密 pH 計 DELTA 320 Mettlor Toledo/中國恒溫水浴鍋 DFD-700 東方電工機械廠/中國旋渦混合器 XW-80A 上海青浦滬西儀器廠消化爐 HYP-II 上海纖檢儀器有限公司/中國流式細(xì)胞儀 FACS Calibur Becton Dickson/美國倒置電子顯微鏡 JEM-1200EX 日本日立公司低速臺式離心機 TGL-16B 上海安亭科學(xué)儀器廠/中國酶標(biāo)儀 Model 680 BIO-RAD /美國超凈工作臺 HVD-1320 北京東聯(lián)哈爾儀器公司/中國全自動凱氏定氮儀 Foss2400 Foss 公司/中國3 研究的技術(shù)路線究的技術(shù)路線如圖 2-1 所示：

F、LF-Cu-10 和 LF-Cu-40 對 ConA 誘導(dǎo)的脾細(xì)胞中 T 淋巴細(xì)胞亞群分型的影CD4+; Q1：CD8+）白對照； (B)：LF（10 μg/mL）；(C)：LF-Cu-10（10 μg/mL）；(D)：LF-C；(E)：LF（40 μg/mL）；(F)：LF-Cu-10（40 μg/mL）；(G)：LF-Cu-40（40 Effects of LF, LF-Cu-10, and LF-Cu-40 on T-lymphocyte subpopulations (Q4, C in ConA-stimulated splenocytes. The cells were cultured with culture medium atreated with LF, LF-Cu-10, and LF-Cu-40 at dose level of 10 μg/mL (B D), or trethem at dose level of 40 μg/mL (E G), respectively.空白組細(xì)胞相比，LF-Zn-10 處理的細(xì)胞 CD4+比例增加（36.9-40.4%），CD 15.4%）。LF-Zn-10 在 10 μg/mL 劑量下對 CD4+呈現(xiàn)較強的刺激作用，而在 激作用減弱。對 CD8+來說，LF-Zn-10在 10 μg/mL劑量下的作用不顯著而在現(xiàn)出一定的抑制作用。LF-Zn-40 在 10 μg/mL 劑量下顯示出刺激作用，CD.5%，但是 CD8+比例變化不顯著（為 15.6%）。然而，LF-Zn-40 在 40 μg/m的抑制作用，CD4+和 CD8+比例均下降�？偠灾�，LF-Zn-10 和 LF-Zn-40 在 能導(dǎo)致 CD4+比例增加，而在 40 μg/mL 劑量下導(dǎo)致 CD4+比例降低或增加幅是，LF-Zn-10 和 LF-Zn-40 處理后，CD4+/CD8+值分別為 2.62 2.79 和 2.210 和 LF-Zn-40 分別顯示出最強和最弱的能力來提高 CD4+/CD8+比例。這些結(jié)

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本文編號：2743486