【摘要】：花生作為八大類食物過(guò)敏原之一,是一種常見的食物和食品加工原料,可引起嚴(yán)重的過(guò)敏反應(yīng)�；ㄉ�(jīng)常是經(jīng)過(guò)加工之后被食用,但是加工對(duì)花生蛋白致敏性的影響至今還沒(méi)有統(tǒng)一的認(rèn)識(shí),這可能與現(xiàn)有研究中不統(tǒng)一的蛋白提取方法和致敏性評(píng)估方法有關(guān)。探索鮮花生加工后,蛋白提取方法和致敏性評(píng)估方法對(duì)花生蛋白潛在致敏性的影響,揭示熱加工對(duì)鮮花生蛋白的消化性和潛在致敏性的影響,將為花生制品加工的優(yōu)化提供依據(jù)。本論文以新鮮花生為研究對(duì)象,采用不同的熱加工方式進(jìn)行處理,并用丙酮脫脂制備成脫脂粉。一方面利用不同方法提取脫脂粉中的花生蛋白,比較不同提取方法和加工方法對(duì)花生蛋白提取的影響;另一方面利用花生脫脂粉進(jìn)行體外模擬胃腸消化,分析熱加工處理對(duì)蛋白的消化性的影響。最后通過(guò)不同的體外致敏性評(píng)估方法,分析加工前后花生的蛋白提取液和脫脂粉消化產(chǎn)物的IgE結(jié)合能力以及誘導(dǎo)人嗜堿性粒細(xì)胞KU812脫顆粒的能力。研究的主要方法、結(jié)果和結(jié)論如下:1.將新鮮花生進(jìn)行相應(yīng)的處理:鮮花生帶殼水煮(100℃,15 min)、鮮花生去殼水煮(100℃,15 min)、鮮花生帶殼烘烤(170°C,35 min)、鮮花生去殼烘烤(170°C,20 min)和鮮花生去殼油炸(152°C,400 s),之后去殼去紅衣,研磨,丙酮脫脂,得到花生脫脂粉。采用凱氏定氮法測(cè)定各樣品中的總蛋白含量。結(jié)果表明,花生樣品的總蛋白含量為51.84%,經(jīng)過(guò)熱加工后樣品中總蛋白含量為52.29%(帶殼水煮)、51.69%(去殼水煮)、51.78%(帶殼烘烤)、52.71%(去殼烘烤)和54.21%(油炸),即熱加工后花生總蛋白含量無(wú)顯著變化。2.利用三種提取方法從脫脂粉中提取花生蛋白:方法一用50 mmol/L的Tris-HCl(pH 7.2)與脫脂粉10:1的體積質(zhì)量比重復(fù)浸提;方法二用20 mmol/L的Tris-HCl(pH 8.2)與脫脂粉20:1的體積質(zhì)量比混合浸提取;方法三用高序列離液劑與脫脂粉以50:1的體積質(zhì)量比混合,超聲提取。利用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定所得提取液中的蛋白濃度并計(jì)算提取率,通過(guò)電泳分析各提取液中的蛋白組分差異。結(jié)果表明,方法一和方法二對(duì)熱加工后花生中蛋白的提取率分別處于7.20%~18.58%和5.21%~23.24%范圍內(nèi),顯著低于各自對(duì)未加工花生的蛋白提取率(45.35%,40.77%)。從電泳結(jié)果可以看出方法三提取得到的花生蛋白所含的蛋白組分條帶最多;分析各過(guò)敏原組分含量可知,在Tris-HCl緩沖液(方法一和方法二)提取的提取液中,熱加工明顯降低了Ara h 1單體的提取率,方法一對(duì)未加工花生樣品中的Ara h 1單體的提取率為29.55%,而熱加工后的提取率最高僅有1.57%(去殼烘烤)。在方法三得到的提取液結(jié)果中可以看到,烘烤雖降低了Ara h 1和Ara h 2等蛋白單體的提取效率,但提取獲得了較多的高分子量蛋白聚集體。3.利用圓二色光譜法和紫外光譜法測(cè)定花生蛋白提取液的高級(jí)結(jié)構(gòu),利用Tricine-SDS-PAGE鑒定脫脂粉中花生總蛋白的消化性。結(jié)果表明,不同提取方法得到的花生蛋白的高級(jí)結(jié)構(gòu)不同。方法一提取得到的帶殼烘烤、去殼烘烤和油炸花生蛋白的α-螺旋含量(分別為24.05%,15.70%,11.80%)比方法二中對(duì)應(yīng)樣品的α-螺旋含量高(分別為3.05%,8.75%,5.45%)。在方法三的提取過(guò)程中,花生蛋白的結(jié)構(gòu)會(huì)被破壞,對(duì)鮮花生未加工樣品而言,方法一和方法二所提取得到的花生蛋白中α-螺旋含量在20%左右(分別為23.10%和20.05%),而方法三提取得到的未加工花生蛋白中α-螺旋含量?jī)H有7.10%。熱加工也會(huì)影響花生蛋白的高級(jí)結(jié)構(gòu),表現(xiàn)為α-螺旋或β-結(jié)構(gòu)含量的降低,使得花生蛋白結(jié)構(gòu)展開或無(wú)序。4.利用競(jìng)爭(zhēng)抑制ELISA法鑒定花生蛋白提取液和花生脫脂粉胃腸消化產(chǎn)物的IgE結(jié)合能力,并利用BLI方法測(cè)定過(guò)敏原與IgE的結(jié)合常數(shù)。結(jié)果顯示,BLI方法的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與ELISA檢測(cè)結(jié)果高度一致。在Tris-HCl(方法一和方法二)提取的情況下,帶殼水煮處理和帶殼烘烤處理可以顯著降低花生蛋白的IgE結(jié)合能力,去殼烘烤處理不會(huì)顯著影響花生蛋白的IgE結(jié)合能力,油炸增強(qiáng)了花生蛋白的IgE結(jié)合能力。方法一中各樣品的IC_(50)值為:未加工1.22μg/mL、帶殼水煮3.29μg/mL、去殼水煮1.81μg/mL、帶殼烘烤2.78μg/mL、去殼烘烤0.95μg/mL和油炸0.73μg/mL,方法二中各樣品的IC_(50)值為:未加工1.14μg/mL、帶殼水煮3.77μg/mL、去殼水煮2.74μg/mL、帶殼烘烤4.93μg/mL、去殼烘烤1.25μg/mL和油炸0.67μg/mL。在方法三提取得到的花生蛋白中(鮮花生未加工樣品IC_(50)=11.02μg/mL),帶殼水煮(IC_(50)=13.12μg/mL)和去殼水煮(IC_(50)=10.76μg/mL)均不會(huì)顯著影響花生蛋白的IgE結(jié)合能力,而烘烤(帶殼烘烤和去殼烘烤)和油炸(IC_(50)分別為7.84μg/mL,6.64μg/mL,3.29μg/mL)處理可以顯著提高花生蛋白的IgE結(jié)合能力。這說(shuō)明不同的提取方法,會(huì)影響花生蛋白的IgE結(jié)合能力的檢測(cè)結(jié)果。對(duì)脫脂粉進(jìn)行體外模擬消化后,不同熱加工花生的脫脂粉消化產(chǎn)物的IgE結(jié)合能力均低于未加工花生,經(jīng)過(guò)胃消化后,不同處理樣品的IC_(50)值分別為:未加工3.13μg/mL,帶殼水煮5.67μg/mL,去殼水煮4.70μg/mL,帶殼烘烤20.42μg/mL,去殼烘烤6.33μg/mL,油炸5.93μg/mL;經(jīng)過(guò)腸消化后,不同處理樣品的IC_(50)值分別為:未加工0.48μg/mL,帶殼水煮3.92μg/mL,去殼水煮5.05μg/mL,帶殼烘烤22.90μg/mL,去殼烘烤3.43μg/mL,油炸3.98μg/mL。5.利用KU812細(xì)胞模型,通過(guò)測(cè)定過(guò)敏原刺激后,檢測(cè)胞內(nèi)鈣離子水平、上清液β-氨基己糖苷酶、組胺和IL-4等細(xì)胞因子的釋放量,評(píng)價(jià)蛋白提取液和脫脂粉消化產(chǎn)物誘導(dǎo)嗜堿性粒細(xì)胞脫顆粒能力。結(jié)果表明,在Tris-HCl緩沖液進(jìn)行蛋白提取時(shí)(方法一和方法二),較統(tǒng)一的結(jié)果是烘烤處理(帶殼烘烤和去殼烘烤)可以引起較高的細(xì)胞脫顆粒程度,方法一提取的花生蛋白刺激細(xì)胞后,細(xì)胞內(nèi)的鈣離子水平分別為:未加工65.17%,帶殼烘烤80.26%,去殼烘烤74.41%,上清液中組胺釋放量分別為:未加工7.90ng/mL,帶殼烘烤9.94ng/mL,去殼烘烤11.11 ng/mL;方法二提取得到的花生蛋白刺激細(xì)胞后,細(xì)胞內(nèi)的鈣離子水平分別為:未加工68.66%,帶殼烘烤73.23%,去殼烘烤組為70.79%,上清液中組胺釋放量分別為:未加工8.12 ng/mL,帶殼烘烤10.05ng/mL,去殼烘烤組為9.56 ng/mL;而在方法三提取得到的花生蛋白提取液中,各樣品的花生蛋白刺激細(xì)胞后產(chǎn)生的各細(xì)胞因子的水平變化不一;經(jīng)胃腸消化后,水煮處理(帶殼水煮和去殼水煮)的花生刺激細(xì)胞可引起四種細(xì)胞因子不同程度的降低,即細(xì)胞脫顆粒程度降低,去殼烘烤花生蛋白可引起細(xì)胞因子釋放水平和胞內(nèi)鈣離子水平的升高,增強(qiáng)了細(xì)胞脫顆粒程度,帶殼烘烤和油炸處理則不會(huì)顯著地影響花生的潛在致敏性。
【圖文】：

圖 2.1 花生總蛋白以及不同提取方法得到的可溶性蛋白的含量PPE 1：方法一提取得到的花生蛋白提取液；PPE 2：方法二提取得到的花生蛋白提取液；PPE 3：方法三提取得到的花生蛋白提取液；DPP：花生脫脂粉。Figure 2.1 The total protein and soluble protein of peanut extracted by different methodsPPE 1: The protein extracts extracted by method 1, PPE 2: The protein extracts extracted bymethod 2, PPE 3: The protein extracts extracted by method 3, DPP: Defatted peanut powder.花生經(jīng)過(guò)熱加工后，研磨，脫脂制備成脫脂粉并衡重，通過(guò)凱氏定氮法檢測(cè)熱加工前后各花生樣品中的總蛋白含量，由圖 2.1 可知，帶殼水煮、油炸和去殼烘烤處理后花生總蛋白含量略高于鮮花生未加工組，但均不具有顯著性差異，故，熱加工處理并不會(huì)影響花生中總蛋白含量，且花生脫脂粉中總蛋白含量在51.69%~54.22%之間。利用三種不同的蛋白提取方法進(jìn)行花生脫脂粉中可溶性蛋白的浸提。方法一可以從鮮花生未加工樣品中提取約 45.35%的蛋白，，但是加工處理后，可提取的蛋白量顯著降低，從水煮鮮花生樣品中分別提取得到 18.58%和 15.68%的蛋白，

第 2 章 熱加工鮮花生的蛋白提取以及數(shù)量分析3、38、36 kDa）處缺失一個(gè)條帶，且無(wú)低分子量的彌散一可以提取得到所有需要的過(guò)敏原條帶，但可能由于提降解，此外，方法一和方法二不適合提取熱加工花生中物，方法二和方法三都可能導(dǎo)致 Arah3/4 條帶的丟失，干擾提取得到更多的 Ara h 1 和高分子量聚集物，高分加工引起蛋白結(jié)構(gòu)的變化具有很重要的價(jià)值，可以反映敏原蛋白的整體變化。另外，研究還發(fā)現(xiàn)經(jīng)過(guò)烘烤和油聚集。A
【學(xué)位授予單位】：南昌大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：TS201.21

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本文編號(hào)：2707016