發(fā)布時間：2020-05-21 00:42

【摘要】：新霉素和鏈霉素是被廣泛應(yīng)用于畜牧業(yè)中的氨基糖苷類抗菌藥物,不合理的使用會造成其在動物源性食品中的殘留,被人類食用后會對健康產(chǎn)生不利影響。因此,建立一種適用于現(xiàn)場檢測新霉素和鏈霉素的快速檢測方法,是強化市場監(jiān)管所迫切需要的。適配體是一種對特定靶標具有高親和力的單鏈寡核苷酸;量子點(QD)是一種可單一波長激發(fā)、多波長發(fā)射的納米熒光材料;兩者的結(jié)合可實現(xiàn)對新霉素和鏈霉素的高特異性和高親和性的標記,有助于實現(xiàn)兩者殘留的同時快速熒光檢測。本文對新霉素和鏈霉素適配體的篩選,適配體-QD復(fù)合熒光探針的制備,以及建立基于此熒光探針的多殘留檢測方法開展了研究,具體研究結(jié)果如下:(1)建立了篩選高特異性新霉素和鏈霉素適配體的方法。獲得的主要方法參數(shù)包括:羧基化磁珠與新霉素和鏈霉素偶聯(lián)的最大質(zhì)量比為34:1和26:1;PCR退火溫度60℃;上下游引物比例為30:1。(2)利用該方法首次獲得彼此無交叉識別作用的高特異性新霉素適配體N1和鏈霉素適配體S11。適配體對新霉素和鏈霉素具有高親和性,解離常數(shù)K_d值分別為40.96±11.56 nmol/L和44.94±7.37 nmol/L。(3)首次建立了采用Non-SELEX篩選鏈霉素適配體的方法,0-17 min為靶標-ssDNA復(fù)合物收集時間窗口。經(jīng)過僅3輪篩選即可得到親和力穩(wěn)定的適配體候選物。利用該方法獲得的適配體NS2對鏈霉素具有高親和性和高特異性,解離常數(shù)K_d值為26.56±8.57 nmol/L。(4)優(yōu)化了制備可以對新霉素和鏈霉素進行高特異性和高親和性標記的兩種復(fù)合熒光探針的條件,其中QD1和QD2的發(fā)射波長分別為548和580 nm;活化時間分別為4和15 min,QD1與N1及QD2與NS2的摩爾比分別為1:1.95和1:1.41;形成的偶聯(lián)物N1-QD1和NS2-QD2的濃度分別為123和81 nmol/L;它們與氧化石墨烯(GO)生成復(fù)合熒光探針的反應(yīng)時間為30 min,GO在兩種復(fù)合熒光探針N1-QD1/GO和NS2-QD2/GO中的濃度均為300μg/mL。(5)首次建立了基于兩種復(fù)合熒光探針對新霉素和鏈霉素進行多殘留快速檢測的方法,樣品與熒光探針的反應(yīng)時間為30 min,新霉素和鏈霉素檢測的測定波長分別為550和586 nm,校正波長分別為618和518 nm。方法對新霉素和鏈霉素的線性檢測范圍分別為50-1000μg/L和10-1000μg/L,檢出限分別為10.02和6.65μg/L。方法在牛奶樣品中對新霉素和鏈霉素的加標回收率分別在96.12%-104.65%和95.86%-106.69%,且對兩種抗生素具有良好的特異性。
【圖文】：

圖 2.1 羧基化磁珠的 TEM 圖Figure 2.1 TEM image of carboxylated magnetic beads標的新霉素或鏈霉素與磁珠偶聯(lián)的反應(yīng)中，需要測定標的濃度。新霉素和鏈霉素均為氨基糖苷類抗生素， 190 nm 處具有強紫外吸收。因此，可以將苯甲酸作行緩沖液中，采用 CE 方法測定溶液中靶標的濃度。、0.1、0.2、0.5 g/L 的新霉素、鏈霉素溶液進行 CE示，，其中 0.2 g/L 靶標的 CE 譜圖如圖 2.3 所示。40000004500000NeomycinY=4.3529×106X+2.2874×106(R2=0.9989)StreptomycinY=2.0482×106X+2.3012×106(R2=0.9958)

新霉素和鏈霉素適配體的篩選及量子點標記多殘留檢測研究的優(yōu)化是指引物與模板結(jié)合時的參數(shù)，是影響 PCR 擴增的重要火溫度可以保證擴增的有效進行，而較高的退火溫度則有。分別將退火溫度設(shè)置為 51、55、58 和 60 ℃進行 PC凝膠電泳鑒定，結(jié)果如圖 2.5 所示。當退火溫度為 51 ℃相對比較擴散；退火溫度為 60 ℃時，條帶雖然較淡，但比選需要進行多輪，應(yīng)避免大量的非特異性擴增，因此選擇
【學(xué)位授予單位】：江蘇大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：TS207.53;O657.3

【參考文獻】

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本文編號：2673462