發(fā)布時間：2020-05-11 20:40

【摘要】：氧化反應是生物體在新陳代謝過程中常發(fā)生的活動,活性氧(ROS)和活性氮(RN)作為其主要產物,在生理功能中起著雙重作用�；瘜W修飾的抗氧化劑對人體構成潛在危害而存在使用限制,所以從動植物中獲取具有較高安全性和較高活性的天然抗氧化物質,對機體提高自身抗氧化能力具有重要意義。河蜆是一種雙殼貝類,廣泛分布于我國內陸水域,具有很高的營養(yǎng)價值。本文通過分離純化技術提取河蜆中抗氧化肽,并進一步研究其對化學急性肝損傷的保護作用。研究結果如下:首先以河蜆軟體為原料,對其營養(yǎng)成分及營養(yǎng)品質進行了比較和分析。結果表明:河蜆軟體部分水分含量為86.64%,干樣品中粗蛋白、粗脂肪以及灰分含量分別為62.80%、11.67%和4.82%。樣品中有17種氨基酸(557.87 mg/g),氨基酸種類齊全,其中6種必需氨基酸(206.77 mg/g),占氨基酸總量的37.06%,且必需氨基酸與氨基酸總量構成比例達到國際標準要求。河蜆軟體中還含有較豐富的礦物質,尤其是Cu和Zn元素均高于常見貝類。綜上所述河蜆是一種具有較高營養(yǎng)價值的軟體動物。通過對多肽獲得率、水解度和DPPH自由基清除能力的測定,確定胰蛋白酶為河蜆的最佳水解酶。以DPPH自由基清除能力作為評價指標,進行水解單因素實驗并通過響應面優(yōu)化工藝參數。最終得到最優(yōu)酶解條件為:酶解溫度45℃、pH值7.5、料液比(w/v)1:7.5和酶加量2020 U/g。在此條件下得到的酶解液DPPH自由基的清除率達到62.22%。河蜆軟體水解后,通過超濾系統將多肽分成10 ku、10 ku-5 ku、5 ku三個組分,結果表明5 ku的多肽組分體外抗氧化活性最強。采用Sephadex G-25凝膠層析對分子量小于5 ku的河蜆多肽進一步分離,獲得Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ四組分,通過細胞實驗得出組分Ⅰ具有最強的保護HepG-2細胞免受H_2O_2氧化損傷能力,然后利用DEAE陰離子交換層析將組分Ⅰ分為九個組分,其中F_(Ⅰ-3)具有最強的DPPH自由基清除能力,最終利用RP-HPLC純化得到目標多肽X。通過質譜分析得其分子量為988.3 u,氨基酸序列為KGPAPFYPL。最后,利用CCl_4構建小鼠化學急性肝損傷模型,研究小分子河蜆肽在增強小鼠抗氧化防御系統、抑制促炎癥反應和肝細胞凋亡方面的作用。結果表明,小分子肽對小鼠無毒害作用,并且能夠降低肝臟指數、提高脾臟指數,減少血清中ALT和AST含量,提高肝臟中SOD和CAT含量,減少MDA含量。通過HE染色、免疫組化實驗和TUNEL染色觀察,小分子多肽能夠明顯改善肝臟組織損傷,減少炎癥因子的生成,同時抑制化學損傷導致的肝細胞凋亡。綜上所述,小分子多肽具有保護肝臟的作用。
【圖文】：

建立小鼠化學急性肝損傷模型，研究河蜆軟體小分子多肽對肝損傷的保護作用河蜆藥用和功能性食品的開發(fā)提供理論依據。.4.2 主要研究內容首先對河蜆軟體基本營養(yǎng)成分（水分、蛋白質、脂肪、灰分）和礦物質進行定，并與多種常見淡水和海洋貝類進行分析比較。同時對河蜆軟體氨基酸種類含量進行測定，并對氨基酸品質進行分析評價。以短肽獲得率、水解度以及 DPPH 自由基清除能力作為評價指標，選出河蜆體最適水解酶。通過單因素實驗和響應面優(yōu)化獲得最佳酶解條件。以體外抗氧化能力以及 H2O2氧化損傷 HepG-2 細胞模型作為評價指標，通濾系統、凝膠層析、陰離子交換層析和 RP-HPLC 逐步分離純化，最終獲得目分子多肽，并對目標多肽分子量和氨基酸組成進行測定。建立 CCl4致小鼠化學急性肝損傷模型，從增強小鼠抗氧化防御系統，抑制炎癥反應和細胞凋亡方面，研究小分子河蜆軟體多肽對小鼠肝損傷的保護作。

短肽獲得率、水解度和 DPPH 自由基清除率三個指標確定最解時間、水解溫度、pH、酶加量和料液比五個單因素實驗前提實驗，以 DPPH 自由基清除率為指標確定最優(yōu)酶解條件。分析劑篩選同酶水解河蜆的短肽獲得率和水解度 3.1 可知，胰蛋白酶水解物的短肽獲得率為 42.94%，在相同量的情況下，其短肽獲得率明顯高于其他蛋白酶水解物（P<0.更適合于河蜆軟體的水解。從水解度來看，胰蛋白酶具有較強），，這個結果與 Gbogouri 等人[75]研究酶解鮭魚頭部的蛋白質力、乳液穩(wěn)定性以及 Klompong 等人[76]通過研究不同種類酶蛋白以獲取最優(yōu)抗氧化活性和功能特性相似。這可能是因為胰強酶并且具有最強的水解能力，能夠充分發(fā)揮酶解作用，水解主要由小分子肽組成。
【學位授予單位】：合肥工業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：TS254.1

【參考文獻】

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本文編號：2659032