【摘要】：農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全問題關(guān)乎國民健康和社會穩(wěn)定。農(nóng)藥的不合理使用對環(huán)境甚至是人類健康造成很大威脅,為了滿足農(nóng)藥殘留標(biāo)準(zhǔn)的要求,需要建立一種高靈敏度、高準(zhǔn)確性的檢測方法。生物條形碼免疫分析方法依據(jù)抗體識別抗原,基于膠體金和核苷酸鏈信號放大技術(shù)、磁性納米粒子分離技術(shù)的特性來實現(xiàn)對農(nóng)藥的檢測。微滴式數(shù)字PCR(ddPCR)作為一種絕對定量檢測技術(shù)被廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)、轉(zhuǎn)基因檢測、微生物檢測等領(lǐng)域,還沒有關(guān)于ddPCR檢測農(nóng)藥的報道,本研究將免疫競爭反應(yīng)解離下來的生物條形碼DNA鏈在ddPCR上進(jìn)行定量檢測。主要研究內(nèi)容與結(jié)果為:制備膠體金納米探針和磁性納米探針,設(shè)計了一組特異性很高的PCR擴(kuò)增所需的DNA模板、上下游引物和探針,并優(yōu)化了PCR擴(kuò)增時的退火溫度,上下游引物濃度和探針濃度。對膠體金納米探針和磁性納米探針的工作濃度、甲醇含量進(jìn)行了優(yōu)化。在最優(yōu)條件下建立標(biāo)曲,其三唑磷的檢出限(IC_(10))分別為0.002 ng mL~( 1),IC_(50)的值為0.197 ng mL~( 1)。線性檢測范圍為0.01-20 ng mL~( 1)。對蘋果、黃瓜、卷心菜和大米四種基質(zhì)進(jìn)行了添加回收實驗。該方法的平均回收率在76.9-94.4%之間,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)在10.8-19.9%之間。該方法在蘋果、黃瓜、卷心菜和大米四種樣品基質(zhì)中的回收濃度與LC-MS/MS在四種樣品基質(zhì)的回收濃度做相關(guān)性實驗,發(fā)現(xiàn)線性良好,也證明了基于ddPCR的生物條形碼免疫分析方法的可靠性,可以用于農(nóng)產(chǎn)品中三唑磷農(nóng)藥殘留的限量檢測。建立了基于ddPCR的生物條形碼免疫分析方法同時檢測三唑磷,對硫磷和毒死蜱三種農(nóng)藥,本章設(shè)計了另外兩組DNA鏈、上下游引物和探針。優(yōu)化了這兩組序列PCR擴(kuò)增的退火溫度、上下游引物和探針濃度。優(yōu)化了需要加入對硫磷和毒死蜱抗體的含量和DNA的含量。做了關(guān)于三種抗體之間特異性的實驗,發(fā)現(xiàn)特異性較好。對抗原和抗體的工作濃度進(jìn)行了優(yōu)化。在最優(yōu)條件下建立標(biāo)曲,其三唑磷、對硫磷和毒死蜱的檢出限(IC_(10))分別為0.22 ng mL~(-1),0.45 ng mL~(-1)和4.49 ng mL~(-1)。對蘋果、黃瓜、卷心菜和梨基質(zhì)進(jìn)行了添加回收實驗。該方法的平均回收率在75.5 98.9%之間,RSD在8.3 16.7%之間。該方法在梨中的回收濃度與LC-MS/MS在梨基質(zhì)的回收濃度做相關(guān)性實驗,發(fā)現(xiàn)線性良好,證明了基于ddPCR的生物條形碼免疫分析方法的準(zhǔn)確可靠性。本研究建立的基于微滴式數(shù)字PCR的生物條形碼免疫分析方法能夠同時檢測三唑磷、對硫磷和毒死蜱。也為實現(xiàn)高通量的檢測更多種農(nóng)藥奠定了基礎(chǔ)。
【圖文】：

圖 1.2 數(shù)字 PCR 的基本原理Fig. 1.2 Principles of digita PCR原則，為數(shù)字 PCR 的發(fā)展奠定了基礎(chǔ)gm 公司生產(chǎn)的芯片 dPCR（chip digital ital PCR, ddPCR)和2016年Stilla公司生原理主要是一個樣本被無限的稀釋，每一個單元里，有一個，多個或者沒后再對每個單元格內(nèi)的陽性和陰性信

圖 1.5 脫氧核酶脫氧核糖檢測系統(tǒng)Fig. 1.5 Detection system of DNAzyme biosensor基因的檢測因是現(xiàn)在很敏感的詞匯，科學(xué)家尚未證明轉(zhuǎn)基因帶來的具體危害，，但是也不和生態(tài)系統(tǒng)就是安全無害的，因此對于轉(zhuǎn)基因含量實施監(jiān)測至關(guān)重要(Gao e et al., 2016)。Giraldo 等在文獻(xiàn)中用 ddPCR 對轉(zhuǎn)基因植物進(jìn)行檢測和定量，要求。通過內(nèi)參基因判斷轉(zhuǎn)基因是否插入目標(biāo)基因中，比如說當(dāng)樣品是非轉(zhuǎn)至 11 個微滴，而轉(zhuǎn)基因樣品顯示 161 至 1223 個陽性微滴。qPCR 也可以應(yīng)因事件。但是 ddPCR 是一種更準(zhǔn)確、靈明度更高的方法。因此 ddPCR 對于可追溯性要求的基于牧場的生物技術(shù)應(yīng)用提供了指導(dǎo)和資源(Giraldo et al., 20 PCR，qPCR 和 ddPCR 來檢測加工食品中的轉(zhuǎn)基因水稻品系 TT51-1，在普通油炸或微波樣品中幾乎檢測不到相對較長的靶標(biāo)序列。qPCR 在煮沸，干燥中能檢測到擴(kuò)增熒光信號，但在油炸樣品中幾乎觀察不到。發(fā)現(xiàn)食品加工直檢測。ddPCR 由于其穩(wěn)定性好和準(zhǔn)確性高，對 PCR 反應(yīng)抑制劑的耐受能力原料而成為加工食品中轉(zhuǎn)基因成分檢測的更受歡迎的方法(Wang et al., 2019)。字 PCR 還應(yīng)用于產(chǎn)前診斷（Lee et al., 2015; Camunas-Soler et al., 2018)，癌癥分
【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：TS207.53

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本文編號：2655940