【摘要】：彈性蛋白作為皮膚組成中重要的結構蛋白,在皮膚老化過程中由于彈性蛋白酶等基質金屬蛋白酶含量的升高而被降解,導致皮膚失去彈性,因此,開發(fā)一種彈性蛋白酶抑制肽是抵御或延緩皮膚老化的有效方法,在抗皮膚老化功能性食品中具有非常廣闊的應用前景。本文以牛動脈為主要原料,通過分析Alcalase~?2.4L對牛彈性蛋白的酶解規(guī)律,優(yōu)選彈性蛋白酶抑制活性較高的水解產(chǎn)物進行光損傷動物實驗和成纖維細胞實驗以驗證其功效,并進一步從水解產(chǎn)物中分離、鑒定了4條具有高彈性蛋白酶抑制活性的肽段。在此基礎上,探究了彈性蛋白酶抑制肽對光損傷成纖維細胞的保護作用機理,并對這些肽的消化吸收特性進行了研究。本文主要實驗結果如下:(1)深入研究了Alcalase~?2.4L對牛彈性蛋白的酶解規(guī)律,發(fā)現(xiàn)由于彈性蛋白結構穩(wěn)定難以被深度酶解,其水解度和游離氨基酸含量都很低(最大值分別僅為2.16%和33.23μg/mL)。此外,由于彈性蛋白特殊的氨基酸組成,其水解產(chǎn)物含有較高水平的Gly、Ala、Val、Pro、Leu,這些氨基酸在彈性蛋白水解產(chǎn)物中對于抑制彈性蛋白酶具有重要作用。通過利用二維液相色譜進一步分析彈性蛋白水解產(chǎn)物的指紋圖譜發(fā)現(xiàn)大分子量/極性較小的肽隨酶解時間的增加被深度水解成分子量較小和/或較強極性的肽,且酶解10 h后樣品指紋圖譜趨于一致,結合質譜分析、鑒定了405個多肽,發(fā)現(xiàn)大多數(shù)肽段來自彈性蛋白中含有豐富的疏水重復單元的疏水結構域,而彈性蛋白的C末端區(qū)域中很少有蛋白片段被釋放。(2)攝入彈性蛋白水解產(chǎn)物(Elastin hydrolysates,EH)的小鼠其皮膚含水量及羥脯氨酸含量明顯增加,表皮增生和皮脂腺增生癥狀明顯改善,表明EH可以有效保護皮膚免受紫外損傷。成纖維細胞實驗結果進一步表明,EH可有助于提升光損傷的成纖維細胞細胞存活率,同時,EH能顯著(p0.05)提升光損傷的成纖維細胞中的I型膠原蛋白和彈性蛋白含量,且能夠有效抑制光損傷成纖維細胞中彈性蛋白酶和膠原蛋白酶含量的升高,說明EH能通過降低彈性蛋白酶和膠原蛋白酶含量來減少UV誘導的膠原蛋白和彈性蛋白的流失。(3)以彈性蛋白酶抑制活性為指標,采取超濾、大孔樹脂、C18層析、HPLC等分離技術手段從EH中分離得到具有高抑制活性的組分,并利用UPLC-Q-TOF-MS/MS對其主要肽段進行鑒定,得到了其序列分別為PY,GLPY,GLGPGV和GPGGVGAL四種多肽。通過對以上肽段分子化學合成,進一步發(fā)現(xiàn)四條肽段中GLPY的彈性蛋白酶抑制活性最強,在10 mM濃度下抑制率為58.77%,其次為GPGGVGAL和GLGPGVG,PY的彈性蛋白酶抑制活性最弱。除GLGPGVG對彈性蛋白酶的抑制類型屬于競爭性抑制外,其他三個多肽均為混合抑制類型。GLPY對彈性蛋白酶具有最強的親和力(6.4 kcal/mol),其與彈性蛋白酶之間可形成5個鍵長較短的氫鍵,這可能是其具有最佳彈性蛋白酶抑制活性的主要原因。此外,在GLGPGVG、GPGGVGAL及PY和彈性蛋白酶的之間可分別觀察到5個、3個及1個氫鍵,說明這四種多肽可以通過與彈性蛋白酶發(fā)生分子相互作用以抑制其活性。(4)GLPY等多肽可通過提升光損傷細胞內(nèi)SOD的活性,抑制紫外誘導的ROS的增加,減少細胞的氧化應激反應,從而在兩個方面起到減少光損傷所致成纖維細胞凋亡的作用:一方面通過抑制胞內(nèi)Ca~(2+)離子水平的增加,從而減少Ca~(2+)離子調(diào)節(jié)的線粒體途徑、內(nèi)質網(wǎng)途徑和/或死亡受體蛋白等途徑引起的成纖維細胞凋亡;另一方面,下調(diào)彈性蛋白酶和膠原蛋白酶,并上調(diào)膠原蛋白mRNA表達以促進膠原蛋白合成,最終減少細胞基質的降解,從而抑制成纖維細胞的失巢凋亡;(5)PY,GLPY,GLGPGVG和GPGGVGAL四個多肽均能不同程度地被胃腸道消化酶系降解,其彈性蛋白酶抑制活性在經(jīng)胃腸道消化后均呈現(xiàn)顯著降低的趨勢,其中PY和GPGGVGAL在消化后已不具備彈性蛋白酶抑制活性。GLPY,GLGPGVG消化后活性的降低與其消化產(chǎn)物GL,PY,LGPGVG和G的活性較低有關。在Caco-2模擬小腸吸收模型中,盡管6.50%的GLPY和56.51%的GLGPGVG被小腸細胞刷狀邊界膜的酶及胞內(nèi)酶進一步水解,但仍有較大部分肽段被細胞所直接吸收。GLPY和GPGGVGAL的表觀滲透率分別為1.02×10~-66 cm/s和0.47×10~(-6) cm/s,其中,GLPY較GLGPGVG更易被吸收,且其主要通過轉胞吞途徑被吸收,需消耗能量,其轉運途徑部分依賴于轉運蛋白PepT1。
【圖文】：

1.1.3.2 光老化的信號通路ROS 能氧化并抑制蛋白質-酪氨酸磷酸酶，導致角質形成細胞和成纖維細胞中的 EGF、IL-1 和 TNF-a 等受體的上調(diào)[21]。這種上調(diào)能夠激活 MAP 激酶信號通路，導致轉錄因子激活蛋白 1(AP-1)和核因子-κB(NF-kB)的激活[22]。 AP-1 由兩個亞基組成，包括 c-Fos 和 UV 誘導的 c-Jun。一方面紫外誘導的 c-Jun 組分的過表達可降低 I 型膠原蛋白的合成[23]，另一方面 AP-1 能夠刺激成纖維細胞和角質形成細胞中基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMPs)相關基因的表達。由于 MMPs 活性的提升，包括 I 型和 III 型膠原的 MMP-1(膠原酶)，MMP-3(間充質溶解酶)和 MMP-9(明膠酶)等活性的提升，引起細胞外基質的加速降解[24]，導致細胞結構和功能的損害，甚至導致細胞的失巢凋亡。除了通過 AP-1 的刺激外，UVB 通過損傷成纖維細胞中的 DNA 也可以啟動 MMP-1 上調(diào)的信號。更重要的是，遠低于最小紅斑劑量的 UV 輻照就可以引起 MMPs 活性的增加[25]。

華南理工大學博士學位論文減少 45%-50%導致彈性蛋白合成的減少[46]。另一方面，隨著劇，皮膚中賴氨酰氧化酶的表達減少，原彈性蛋白之間的交聯(lián)新的彈性纖維組裝[47]。此外，在新的彈性纖維中，盡管所有的但它們的結構和功能都受到嚴重的影響[48]——老化皮膚中的松散且細小，微纖維片段縮短。不僅如此，，在衰老過程中，膠加，彈性蛋白和纖維間質膠原的厚度減少，也將導致皮膚結構類似，彈性蛋白也同樣具有生理活性：彈性蛋白及其降解產(chǎn)物誘導一系列細胞活動，包括細胞遷移和增殖、基質合成和蛋白
【學位授予單位】：華南理工大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：TS201.2

【參考文獻】

相關期刊論文 前1條

1 曹文紅;章超樺;;生物活性肽的吸收機制[J];藥物生物技術;2006年05期

相關碩士學位論文 前1條

1 何蘭;牛骨膠原蛋白的提取及復合海綿的制備研究[D];華中農(nóng)業(yè)大學;2012年

本文編號：2638192