【摘要】：鐵是人體必需的微量元素之一,鐵缺乏會(huì)導(dǎo)致人體多種疾病。無(wú)機(jī)鐵穩(wěn)定性差,生物利用率低,有一定毒副作用,而蛋白肽亞鐵螯合物可通過(guò)小腸直接吸收,吸收率高、安全無(wú)消化道刺激,無(wú)副作用,是一種理想的補(bǔ)鐵劑。芝麻粕是芝麻榨油后的副產(chǎn)物,富含蛋白質(zhì)等多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。我國(guó)芝麻粕資源豐富,但通常作為飼料或肥料使用,未能進(jìn)一步綜合利用,造成了資源的極大浪費(fèi)。本文以芝麻粕為原料,探討酶解芝麻蛋白肽及其亞鐵螯合物的制備與特性,為新型鐵補(bǔ)充劑的研發(fā)應(yīng)用提供理論依據(jù)。對(duì)芝麻粕進(jìn)行脫脂處理,采用堿式酸沉法提取芝麻蛋白。選取堿性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶對(duì)芝麻蛋白進(jìn)行酶解,以水解度、亞鐵離子螯合率和DPPH·清除率為指標(biāo),確定堿性蛋白酶為最佳酶源。采用堿性蛋白酶,對(duì)酶解的影響因素(酶解時(shí)間、底物濃度、加酶量、酶解溫度、pH值)進(jìn)行了單因素試驗(yàn),在此基礎(chǔ)上分別以亞鐵離子螯合率和DPPH·清除率為指標(biāo)進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化,結(jié)果表明:制備具有亞鐵螯合活性芝麻蛋白肽的最佳酶解條件為:酶解時(shí)間3 h、底物濃度4.5%、加酶量1500 U/g、酶解溫度45.5℃、pH 10。在此條件下,制備的芝麻蛋白肽亞鐵離子螯合率為62.02%,DPPH·清除率為53.05%;制備具有抗氧化活性芝麻蛋白肽的最佳酶解條件為:酶解時(shí)間3 h、底物濃度4.2%、酶添加量1400 U/g、酶解溫度為47℃、pH 10,在此條件下,制備的芝麻蛋白肽DPPH·清除率為55.42%,亞鐵離子螯合率為55.09%。由于以亞鐵離子螯合率為指標(biāo)優(yōu)化后的最佳酶解條件與以DPPH·清除率為指標(biāo)優(yōu)化后的酶解條件結(jié)果比較相近,而且在酶解芝麻蛋白肽亞鐵螯合能力最高時(shí)其DPPH·清除率達(dá)到了 53.05%,與抗氧化活性肽最優(yōu)酶解條件下的DPPH·清除率相近,因此確定芝麻蛋白最優(yōu)酶解條件為:酶解時(shí)間3 h、底物濃度4.5%、酶添加量1500 U/g、酶解溫度45.5℃、pH 10。將芝麻蛋白酶解液與氯化亞鐵進(jìn)行螯合,制備芝麻蛋白肽亞鐵螯合物。通過(guò)單因素試驗(yàn)考察了 Vc與亞鐵鹽的質(zhì)量比、肽與亞鐵鹽質(zhì)量比、pH值、反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度和乙醇體積倍數(shù)對(duì)芝麻蛋白肽亞鐵螯合物螯合率和產(chǎn)品得率的影響。根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn),得到制備芝麻蛋白肽亞鐵螯合物的最優(yōu)工藝參數(shù)為:Vc與亞鐵鹽的質(zhì)量比0.2:1、肽與亞鐵鹽質(zhì)量比3:1、pH 7.41、時(shí)間17 min、溫度32℃、乙醇添加量為反應(yīng)液體積的6倍。在此條件下,螯合率和產(chǎn)品得率的理論值分別為72.42%、44.60%,在同樣的條件下做驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),得到螯合率和產(chǎn)品得率分別為72.36%、44.68%,與理論值相近。以芝麻蛋白酶解液為原料,經(jīng)超濾與離子交換層析兩步分離得到亞鐵螯合活性和抗氧化活性較高的芝麻蛋白肽。利用超濾法分離純化芝麻蛋白肽,得到F1(10 kDa)、F2(3kDa-10 kDa)、F3(3kDa)三個(gè)組分,三個(gè)組分的亞鐵離子螯合率和DPPH·清除率均存在顯著性差異,組分F3的亞鐵離子螯合率最高,為77.64%,其次是組分F2,為68.51%;組分F1的亞鐵離子螯合率最低,為56.60%;組分F3的DPPH·清除率最高,為62.22%,其次是組分F2,為57.02%,組分F1的DPPH·清除率最低,為48.80%。組分F3再經(jīng)離子交換層析分離得到三個(gè)組分:F3-1、F3-2及F3-3。三個(gè)組分的亞鐵離子螯合率和DPPH·清除率均存在顯著性差異,組分F3-2的亞鐵離子螯合率最高,為84.82%,其次是組分F3-3,為76.63%,組分F3-1的亞鐵離子螯合率最低,為64.64%;組分F3-1的DPPH·清除率最高,為67.98%,其次是組分F3-2,為63.22%,組分F3-3的DPPH·清除率最低,為58.05%。通過(guò)硫化鈉法對(duì)芝麻蛋白肽亞鐵螯合物的成分進(jìn)行了定性研究,確定螯合物中不存在游離的蛋白肽,進(jìn)而確定蛋白肽與亞鐵離子已充分螯合;通過(guò)紅外光譜分析對(duì)芝麻蛋白肽及其亞鐵螯合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定,確定螯合產(chǎn)物的生成,同時(shí)推測(cè)鐵可能與肽結(jié)構(gòu)的氨基、羰基和羧酸基團(tuán)結(jié)合有關(guān)。氨基酸組分分析的結(jié)果顯示芝麻蛋白肽螯合前后氨基酸比例發(fā)生變化,其中酸性氨基酸天冬氨酸、谷氨酸與胱氨酸、組氨酸、丙氨酸、蛋氨酸、亮氨酸含量增加,表明酸性氨基酸的羧基與氨基酸殘基的吲哚基、咪唑基等活性基團(tuán)對(duì)亞鐵螯合能力起到了重要作用。在體外模擬胃腸道消化環(huán)境,考察芝麻蛋白肽亞鐵螯合物的生物利用度。對(duì)比葡萄糖酸亞鐵以及無(wú)機(jī)鐵(FeSO4)的生物利用度,結(jié)果表明芝麻蛋白肽亞鐵螯合物的生物利用度高于葡萄糖酸亞鐵及FeSO4:胃中消化2 h后,Fe2+的釋放率達(dá)90%以上;芝麻蛋白肽亞鐵螯合物依賴于胃酸的酸化能緩慢釋放Fe2+,對(duì)胃的刺激性弱于葡萄糖酸亞鐵和無(wú)機(jī)鐵;芝麻蛋白肽亞鐵螯合物受pH影響小于葡萄糖酸亞鐵和無(wú)機(jī)鐵,穩(wěn)定性較高;胃腸中消化8 h后芝麻蛋白肽亞鐵螯合物的溶解度和透析率均在40%以上,溶解度和透過(guò)率均高于葡萄糖酸亞鐵和FeSO4。
【圖文】：

邐１５逡逑按２．３．４的方法酶解，得到不同蛋白酶對(duì)芝麻蛋白水解度的影響如圖２－１所示。逡逑３（＞邋Ｉ＂邋＋中性蛋白酶逡逑一木瓜蛋白酶逡逑｜邐．邐Ｉ邐．邐Ｉ邐．邐Ｉ邐？邐Ｉ邐．邐Ｉ邐．ｉ．ｉ逡逑０邐１邐２邐３邐４邐５邐６邐７逡逑酶解時(shí)間（ｈ）逡逑圖２－１不同蛋白酶對(duì)芝麻蛋白水解度的影響逡逑Ｆｉｇ．邋２－１邋Ｅｆｆｅｃｔ邋ｏｆ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ邋ｐｒｏｔｅａｓｅ邋ｏｎ邋ｔｈｅ邋ｄｅｇｒｅｅ邋ｏｆ邋ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ邋ｏｆ邋ｓｅｓａｍｅ邋ｐｒｏｔｅｉｎ逡逑如圖２－１所示，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，三種酶酶解芝麻蛋白的ＤＨ都在增大，０－４邋ｈ內(nèi)ＤＨ逡逑隨時(shí)間增加迅速，之后增速緩慢并趨于平緩。產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因主要有以下三點(diǎn)：（丨）在酶逡逑解反應(yīng)初始階段，蛋白酶的濃度較高，活性較好，可斷裂的肽鍵數(shù)目多，因此，水解度上升逡逑最快；（２）隨著酶解反應(yīng)的進(jìn)行，酶的濃度逐漸降低，活性也隨之降低，酶的活性部位逐漸逡逑飽和；（３）酶解產(chǎn)物低分子量的蛋白肽對(duì)酶解反應(yīng)具有較強(qiáng)的抑制作用，從而使反應(yīng)速度變小逡逑并趨于平緩。同時(shí)，從圖中可以看出，三種蛋白酶酶解芝麻蛋白的效果不同，其中堿性蛋白逡逑酶的酶解能力最強(qiáng)，其次是木瓜蛋白酶，中性蛋白酶酶解能力最差。有研究表明，堿性蛋白逡逑酶適合用來(lái)酶解堿提酸沉法制備的植物蛋白

Ｆｉｇ．邋２－９邋Ｒｅｓｐｏｎｓｅ邋ｓｕｒｆａｃｅ邋ａｎｄ邋ｃｏｎｔｏｕｒ邋ｐｌｏｔｓ邋ｏｆ邋ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ邋ｂｅｔｗｅｅｎ邋ｅｎｚｙｍａｔｉｃ邋ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ邋ｔｉｍｅ邋ａｎｄ邋ｓｕｂｓｔｒａｔｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ逡逑邐邐亞鐵離子蝥合中邐邐逡逑：〔口邐．孑，逡逑Ｉ邐ｖ，＂逡逑Ｓ３邋＾邋邋邐邐邐一＾逡逑１２５０ｏｏＭＯｔ邋－ｔ＂７＾邐１邋邋邐１邐－￡：—ｉ邋，，逡逑ｃ：邋ｂｌｉＭｔ邐？曑、久故咖間邐１００邐，ｓｏ邐１００邐，Ｍ邐４ｔ＂逡逑５００邋００邋２邋００逡逑Ａ：邋？（＊？ｍｆ－＜ｉ逡逑圖２－１０酶解時(shí)間和加酶量相互作用的響應(yīng)面圖和等高線圖逡逑Ｆｉｇ．邋２－１０邋Ｒｅｓｐｏｎｓｅ邋ｓｕｒｆａｃｅ邋ａｎｄ邋ｃｏｎｔｏｕｒ邋ｐｌｏｔｓ邋ｏｆ邋ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ邋ｂｅｔｗｅｅｎ邋ｅｎｚｙｍａｔｉｃ邋ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ邋ｔｉｍｅ邋ａｎｄ邋ｅｎｚｙｍｅ逡逑ｌｏａｄｉｎｇ逡逑—邋．「ｐ邐亞鐵離代合邋ｔ＾逡逑
【學(xué)位授予單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：O641.4;TS201.2

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本文編號(hào)：2636472