具有酯化活性的脂肪酶在化妝品行業(yè)、生物柴油、食品行業(yè)和精細化工等酶法制造中具有極其重要的應用價值。為了滿足工業(yè)生產的需求,尋找酯化活性脂肪酶為工業(yè)生產所急需。本文克隆了黑曲霉脂肪酶基因并在畢赤酵母中進行表達,進一步解析其酶學性質及其酯化活性。獲得如下主要結果:從黑曲霉F0215中,成功擴增脂肪酶基因tglE,大小為801bp,編碼266個氨基酸殘基,預測分子量為28kDa。通過模擬蛋白結構分析,Ser139、Asp195、His248為其催化中心氨基酸殘基組成;成功構建了重組畢赤酵母菌株GS115-tglE;搖瓶水平上,TglE的發(fā)酵液酶活達到32.88 U/mL;進一步搖瓶發(fā)酵制備酶液并進行純化,經過硫酸銨鹽析、PD-10除鹽、凝膠柱層析純化,聚丙烯酰胺凝膠電泳分析,分子量大小約為32 kDa,比酶活為137.08 U/mg,純化倍數為13.95,得率為13.36%。對純化后的脂肪酶TglE進行酶學性質分析表明,脂肪酶的最適作用溫度為40℃,最適作用pH為7.0,在20-30℃和pH6.0-8.0條件下具有良好的穩(wěn)定性;Cu2+、Mrn2+、Ca2+、K+、Mg2+、Sn2+、二甲基亞砜、甲醇和庚烷對脂肪酶TglE的水解活性有促進作用,Ca2+和庚烷的促進作用較明顯;Fe3+、Zn2+、EDTA、乙酸甲酯和十二烷對脂肪酶TglE的活性有抑制作用,其中金屬離子螯合劑EDTA和十二烷的抑制作用較明顯;脂肪酶對C4底物的作用最強,對C16底物的作用最弱,為以C4為底物的30.96%;它對橄欖油的作用最強,對棕果油的作用最弱,為以橄欖油為底物的45.45%;動力學常數的研究表明,脂肪酶TglE的Km值為14.40 mmol/L,V/Lx為46.72 mmol/(L·h)。確認了脂肪酶TglE具有酯化活性。通過氣相色譜分析,脂肪酶在以十二烷為溶劑,反應體系中酸濃度為0.3 mol/L,辛酸與乙醇摩爾比為1:2.4的條件下,12 h催化辛酸和乙醇酯化的轉化率為36.84%。本文成功將黑曲霉脂肪酶基因在畢赤酵母中克隆表達,系統研究了其酶學性質及酯化活性,為其在工業(yè)中應用做出初步探索。
【學位單位】：天津科技大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：TQ925.6
【部分圖文】：

，。濃度測定方５去??ＣＡ蛋白濃度測定試劑盒（北京索萊寶科技有限公司），按照試酶酶活測定方法??標堿滴定法??標?ＧＢ／Ｔ?２３５３５－２００９１８５】??義：１?ｇ固體酶粉（或１?ｍＬ液體酶），在一定溫度和ｐＨ條件，叩１〇１的可滴定的脂肪酸，即為１個酶活力單位，以Ｕ／ｇ（Ｕ／ｍＬ）硝基苯酚法??獻報道，對硝基苯酚法測定脂肪酶酶活方法如下［８６１：??曲線繪制??０１?ｍＭ、０．０２?ｍＭ、０．０３?ｍＭ、０．０４?ｍＭ、０．０６?ｍＭ、０．０８?ｍＭ?的，分別在４１０?ｎｍ下測定吸收值，繪制標準曲線，如下圖。??

根據網上注釋信息，這沉基因序列全長為８６１?ｂｐ，編碼氨基酸個數為２８６個。在??丹麥技術大學生物序列分析中心（ＣＢＳ?）的網站（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＳｉｇｎａｌＰ?），??通過ＳｉｇｎａｌＰ平臺對其編碼的氨基酸序列信號肽切割位點進行預測，結果如圖３－１。從??信號肽預測結果來看，這沉基因編碼的氨基酸序列的Ｎ末端包含一個典型的信號肽序??列（ｌ－２０ａｖ），信號肽切割位點為：ＬＡＶ－ＰＭ。設計引物時去除編碼信號肽的序列。??９ｇｎａｌＰ－４?１?ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ?（ｅｕｋ?ｎｅｔｗｏｒｋｓ）?Ｓｅｑｕｅｎｃｅ??￣?Ｇｓｃｏｒｅ＇??１?０?Ｓｓｃｏｒｅ???？??Ｙ－ｓｃｏｒｅ????０?８??，．?ｊ?：??１。４．—一．??０?２?？??ａ。川丨丨｜丨丨｜丨丨丨丨丨丨丨｜｜丨｜?ｉｉｉｉｉｉｉ?ｉｌｍｎｉｉｆｆｌｉｎＭＭｉｉ??ＭＲＶＧＫＳＴ?ＬＦＧＧＬＡＬＴ?ＰＩＴ?ＵＶ?ＭＨＯＳＲＡＴＳＯＰＡＥＷＴ?ＥＬＨＲＡＡＯｌＳＳＡＡ?ＹＴＱＣＴ６ＳＡ?ＦＤＶＴ?ＩＴ?ＫＯＩ?ＩＩＥＩＶ１??０?１０?２０?３０?４０?５０?６０?７０??Ｐｏｓｉｔｉｏｎ??圖３－１吃／￡蛋白信號肽序列預測結果??Ｆｉｇ．?３－１?Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ?ｏｆ?Ｓｉｇｎａｌ?ｐｅｐｔｉｄｅ?ｓｅｑｕｅｎｃｅ?ｏｆ?ｔｌｇＥ?ｐｒｏｔｅｉｎ??３．２脂肪酶基因這／￡的克隆??３．２．１?Ａｓ＾ｅｒｇ７’／／ｕｓ?廠?Ｆ０２１５?總?ＲＮＡ?的提取??按照２．２．２．１中方法提取黑曲霉Ｆ０２１５總ＲＮＡ

１?２??ＥＳＫ３—１８Ｓ??圖３－２黑曲霉Ｆ０２１５總ＲＮＡ電泳結果??Ｆｉｇ．?３－２?Ａｇａｒｏｓｅ?ｇｅｌ?ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ?ｏｆ?ｔｏｔａｌ?ＲＮＡ?ｏｆ?Ａ．?ｎｉｇｅｒ?Ｆ０２１５??１，２均為黑曲霉總ＲＮＡ??３．２．２脂肪酶基因這／￡的擴增??以黑曲霉總ＲＮＡ為模板，反轉錄合成ｃＤＮＡ，具體操作步驟按照試劑盒說明書??進行。合成的ｃＮＤＡ適當稀釋后作為模板，按照２．２．５中方法，通過ＰＣＲ反應，對目??的基因戌／￡進行擴增。ＰＣＲ產物電泳結果如圖３－３所示，大小約為０．８?ｋｂ，無其它雜??帶，黑曲霉脂肪酶基因故／￡預期大小為８０１?ｂｐ，與電泳結果相吻合，可以進行載體構??建，并測序。??Ｍ?１??１?Ｋｂ——■鑛＿??０．７５?Ｋｂ——ｊ??圖３－３目的基因／ｇ／Ｅ?ＰＣＲ電泳結果??Ｆｉｇ．?３－３?Ａｇａｒｏｓｅ?ｇｅｌ?ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ?ｏｆ?ｔａｒｇｅｔ?ｇｅｎｅｓ?ｔｇｌＥ??Ｍ：?Ｍａｒｋｅｒ，?１：目的基因?
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本文編號：2853348