發(fā)布時間：2018-08-12 16:23

【摘要】：昆蟲在外界不良生存環(huán)境下能夠有效地抵御外源病菌的入侵,除了機(jī)體保護(hù)色和物理屏障如鱗毛、甲殼和角質(zhì)表皮外,昆蟲也具有識別和除清體內(nèi)異原物的高效免疫系統(tǒng),用來抵御微生物的寄生和感染,因而其先天性免疫應(yīng)答機(jī)制的研究備受廣泛關(guān)注,這對闡釋生物的起源進(jìn)化、多樣性研究和生長發(fā)育有重要的意義。本研究以鱗翅目昆蟲柳蠶為研究對象,對柳蠶的defense基因和apolipophorin-Ⅲ(ApoLp-Ⅲ)基因進(jìn)行了克隆、鑒定、比較和進(jìn)化研究,也初步探討了它們的誘導(dǎo)調(diào)控模式和功能,以期豐富鱗翅目昆蟲先天免疫防御機(jī)制的理論基礎(chǔ),有利于我們了解新的昆蟲防御對策和病原物感染模式。本研究主要內(nèi)容與結(jié)果如下:1.從柳蠶中克隆并鑒定了defense基因,全長包含691個核苷酸預(yù)測的開放閱讀框498 bp,編碼165個氨基酸殘基并有一個卷曲結(jié)構(gòu)。defense蛋白的序列與其他鱗翅目昆蟲如蓖麻蠶、柞蠶、尺蠖、家蠶、美國白蛾、煙草天蛾等的defense蛋白序列有較高的同源性。在大腸桿菌中defense與表達(dá)載體PET-32a(+)連接并成功表達(dá)出包涵體和可溶性蛋白,并制備多克隆抗體用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。實(shí)時定量PCR和蛋白印跡檢測結(jié)果表明defense基因在脂肪體中有特別高的表達(dá)水平量,對柳蠶進(jìn)行免疫刺激后表明,defense基因可以被大腸桿菌、微黃藤球菌和核型多角體病毒刺激上調(diào)表達(dá),并表現(xiàn)出對真菌、病毒和革蘭氏陽性菌較強(qiáng)的敏感性,而對革蘭氏陰性菌的敏感性較弱。抑菌圈實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了抑菌圈直徑接近相同時,革蘭氏陽性菌所需的時間比陰性菌要短。這些數(shù)據(jù)說明,defense基因在柳蠶的先天免疫應(yīng)答中起著重要的作用。2.同時從柳蠶中克隆分離出ApoLp-Ⅲ基因,它包含660個核苷酸,預(yù)測的開放閱讀框561 bp并編碼186個氨基酸組成的蛋白,柳蠶ApoLp-Ⅲ蛋白序列與其他物種昆蟲的ApoLp-Ⅲ蛋白序列同源性很高,尤其是柞蠶。重組的ApoLp-Ⅲ質(zhì)粒在大腸桿菌中表達(dá)出可溶性的重組蛋白,并制備了多克隆抗體。qRT-PCR檢測柳蠶ApoLp-Ⅲ基因在脂肪體和表皮中表達(dá)量較高,而在血細(xì)胞、性腺、絲腺、馬氏管和中腸中很低。在抵御外源物如大腸桿菌、藤黃微球菌、球孢白僵菌和核型多角體病毒入侵時,ApoLp-Ⅲ基因均被上調(diào)表達(dá),并表現(xiàn)出對革蘭氏陰性菌和真菌比對革蘭氏陽性菌和病毒有更高的靈敏度。通過RNA干擾實(shí)驗(yàn),下調(diào)的ApoLp-Ⅲ基因直接或間接地影響著超氧化物歧化酶Cu/ZnSOD基因的表達(dá)也下調(diào),這些在免疫應(yīng)答反應(yīng)中起重要作用的相關(guān)基因之間可能存在著一定的相互作用的關(guān)系。
[Abstract]:Insects can effectively resist the invasion of exogenous bacteria in the poor living environment of the outside world. In addition to protecting the body's color and physical barriers such as scaly hair, crustaceans and keratinocytes, insects also have an efficient immune system to recognize and remove heterogeneity in the body. Therefore, the study of innate immune response mechanism has attracted much attention, which is of great significance to explain the origin, evolution, diversity, growth and development of organisms. In this study, the defense gene and apolipophorin- 鈪，

本文編號：2179607