MicroRNA(miRNA)在動(dòng)植物體內(nèi)大量存在,并且參與調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)發(fā)育及脅迫應(yīng)答等過(guò)程,但關(guān)于柑橘抗寒資源—枳(Poncirus trifoliata)低溫響應(yīng)miRNA的研究目前還比較少。本論文在前期研究的基礎(chǔ)上,驗(yàn)證了枳中鑒定出的一個(gè)低溫誘導(dǎo)新microRNA(即ptr-miR04)的抗寒功能,并初步解析了它的調(diào)控機(jī)制。主要結(jié)果如下:1.利用pre-miR04前體轉(zhuǎn)化的T2代轉(zhuǎn)基因煙草植株進(jìn)行低溫處理,表型比較及生理指標(biāo)(電導(dǎo)率、ROS等)分析表明轉(zhuǎn)基因植株的抗寒性弱于野生型,暗示ptrmiR04負(fù)調(diào)控植物抗寒性。2.在檸檬中超表達(dá)pre-miR04得到了轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株。低溫處理后,發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因檸檬植株葉片萎蔫程度比野生型嚴(yán)重,而電導(dǎo)率、ROS的含量比野生型高,說(shuō)明超表達(dá)ptr-miR04降低了植株抗寒性。利用STTM技術(shù)構(gòu)建了ptr-miR04干涉載體并轉(zhuǎn)化枳,得到了陽(yáng)性植株。3.生物信息學(xué)預(yù)測(cè)ptr-miR04的靶基因,發(fā)現(xiàn)其中一個(gè)靶基因?yàn)楣?1,6-二磷酸醛縮酶(fructose-bisphosphate aldolase,FBA),低溫處理后對(duì)枳pre-miR04和FB...

【文章頁(yè)數(shù)】：62 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
縮略詞表(Abbreviation)
1 前言
    1.1 課題的提出
    1.2 文獻(xiàn)綜述
        1.2.1 植物低溫脅迫研究進(jìn)展
        1.2.2 柑橘低溫脅迫研究進(jìn)展
        1.2.3 miRNA研究進(jìn)展
            1.2.3.1 植物miRNA的生物合成
            1.2.3.2 植物miRNA的作用機(jī)制
            1.2.3.3 miRNA與植物逆境脅迫
            1.2.3.4 柑橘miRNA研究進(jìn)展
        1.2.4 糖代謝與植物逆境應(yīng)答
    1.3 本研究的目的與意義
2 實(shí)驗(yàn)材料與方法
    2.1 材料
        2.1.1 植物材料
        2.1.2 試劑
        2.1.3 載體及菌株
    2.2 方法
        2.2.1 材料培養(yǎng)與處理
        2.2.2 植物RNA提取及cDNA合成
        2.2.3 植物材料相關(guān)基因表達(dá)模式分析
        2.2.4 枳ptr-miR04靶基因預(yù)測(cè)
        2.2.5 載體構(gòu)建
            2.2.5.1 構(gòu)建短串聯(lián)靶標(biāo)類似物STTM-miR04干涉載體
            2.2.5.2 構(gòu)建瞬時(shí)表達(dá)載體
        2.2.6 大腸桿菌轉(zhuǎn)化及陽(yáng)性鑒定
        2.2.7 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌
        2.2.8 瞬時(shí)轉(zhuǎn)化驗(yàn)證ptr-miR04與靶基因互作
        2.2.9 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的柑橘遺傳轉(zhuǎn)化
            2.2.9.1 材料準(zhǔn)備
            2.2.9.2 遺傳轉(zhuǎn)化
        2.2.10 轉(zhuǎn)基因植株陽(yáng)性鑒定
            2.2.10.1 DNA提取
            2.2.10.2 PCR鑒定
        2.2.11 生理指標(biāo)測(cè)定
            2.2.11.1 相對(duì)電導(dǎo)率測(cè)定
            2.2.11.2 DAB、NBT染色
            2.2.11.3 過(guò)氧化氫(H₂O₂)含量、抗超氧陰離子活力(anti-O2
-)、丙二醛(MDA)含量測(cè)定
            2.2.11.4 過(guò)氧化物酶(POD)活性、總超氧化物歧化酶(SOD)活性、過(guò)氧化氫酶(CAT)活性測(cè)定
            2.2.11.5 可溶性總糖、葡萄糖、果糖、蔗糖含量測(cè)定
        2.2.12 統(tǒng)計(jì)分析
3 結(jié)果與分析
    3.1 煙草T2代轉(zhuǎn)基因植株抗寒性驗(yàn)證
        3.1.1 轉(zhuǎn)基因煙草PCR及表達(dá)量鑒定
        3.1.2 轉(zhuǎn)基因煙草低溫處理表型鑒定
        3.1.3 煙草抗寒生理指標(biāo)測(cè)定
    3.2 轉(zhuǎn)基因檸檬抗寒性驗(yàn)證
        3.2.1 pre-miR04超表達(dá)載體轉(zhuǎn)檸檬及植株陽(yáng)性鑒定
        3.2.2 轉(zhuǎn)基因檸檬抗寒性分析
    3.3 ptr-miR04靶基因預(yù)測(cè)及驗(yàn)證
        3.3.1 ptr-miR04靶基因預(yù)測(cè)
        3.3.2 枳基因表達(dá)量分析初步驗(yàn)證ptr-miR04靶基因
        3.3.3 煙草瞬時(shí)表達(dá)驗(yàn)證ptr-miR04及靶基因FBA的互作
        3.3.4 轉(zhuǎn)基因煙草中pre-miR04與靶基因表達(dá)量分析
    3.4 轉(zhuǎn)基因材料糖含量分析
        3.4.1 轉(zhuǎn)基因煙草糖含量分析
        3.4.2 轉(zhuǎn)基因檸檬糖含量分析
    3.5 STTM-miR04干涉載體構(gòu)建及枳遺傳轉(zhuǎn)化
        3.5.1 STTM-mi R04干涉載體圖
        3.5.2 STTM-miR04干涉載體轉(zhuǎn)化枳及轉(zhuǎn)基因植株鑒定
4 討論
    4.1 ptr-miR04降低植株抗寒能力
    4.2 ptr-miR04可能通過(guò)FBA參與到糖代謝途徑
    4.3 miR04可能參與響應(yīng)多種逆境脅迫
參考文獻(xiàn)
附錄
    Ⅰ 附表
    Ⅱ 附圖
致謝



本文編號(hào)：4032779

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